Analyse in vitro de la réponse immunitaire T dirigée contre des antigènes du cytomégalovirus humain sous forme soluble ou associés à des biovecteurs synthétiques

par Eric Prieur

Thèse de doctorat en Physiopathologie humaine

Sous la direction de Claude de Préval.

Soutenue en 1997

à Toulouse 3 .

mots clés

Résumé

L'infection par le cytomegalovirus humain (cmvh) represente un probleme majeur de sante publique. Environ 80% de la population mondiale est infectee par ce virus. Chez les personnes immunodeprimees naturellement (nouveau-nes), pathologiquement (sida, cancer), ou iatrogeniquement (greffes), l'infection s'accompagne de pathologies souvent mortelles. Lors d'une primo-infection chez une femme seronegative en cours de grossesse, le developpement du ftus risque d'etre affecte, aboutissant a des pathologies invalidantes dont les plus courantes sont associees a des anomalies du systeme nerveux central (deficits sensoriels, retards psychomoteurs). Les proteines virales cibles de la reponse immunitaire naturelle sont connues. Un taux eleve de precurseurs cellulaires t cd4 anti-ie1 et t cd8#+ anti-pp65 a ete mesure chez des donneurs de sang seropositifs asymptomatiques. Les glycoproteines de l'enveloppe virale, en particulier gb et gh, sont les cibles majeures des anticorps neutralisants. L'expression dans la levure saccharomyces cerevisiae de fragments peptidiques de ie1 a permis de localiser l'epitope presente par hla-dr3 a des clones t cd4#+ anti-ie1 dans un fragment correspondant aux 166 acides amines n-terminaux de l'exon 4 (e4, 406 aa) de ie1 (491 aa). Nous developpons un vaccin sous-unitaire constitue par l'association des proteines ie1 et pp65 a des nanoparticules synthetiques de 80 nm de diametre chargees positivement nommees biovecteur (biovector therapeutics, toulouse). Les proteines virales ont ete produites dans escherichia coli fusionnees avec gst ; gst-e4, gst-ie1 et gst-pp65. Une autre construction a permis la production d'une proteine chimere ; gst-ie1-pp65. Le rendement de l'association de l'antigene aux biovecteurs en milieu aqueux etait superieur a 90%. L'association de l'antigene etait stable et le protegeait de la proteolyse. La microscopie optique confocale a permis de montrer que les biovecteurs etaient internalises par des lymphocytes b. In vitro, des clones t cd4#+ anti-ie1 proliferaient lorsque les antigenes solubles ou associes aux biovecteurs etaient presentes par des pbmc, des splenocytes, des lymphocytes b, des macrophages ou des cellules dendritiques. La quantite d'antigene necessaire pour obtenir une proliferation de cellules t cd4#+ anti-ie1 equivalente etaient 25 fois inferieure lorsqu'il etait associe aux biovecteurs. Cette amplification etait accompagnee par une secretion accrue des cytokines il-4 et ifn-gamma. Des travaux ont ete inities afin de determiner les conditions dans lesquelles les formulations associant ie1-pp65 a des biovecteurs permettraient la sensibilisation de cellules cibles a la cytolyse par des effecteurs t cd8 #+anti-cmvh. Ces formulations pourraient permettre l'induction de telles cellules effectrices in vivo. Nous avons montre que des peptides provenant de la degradation par la trypsine de gst-ie1-pp65 sensibilisaient des lymphocytes b a la lyse par des lignees cellulaires t cd8 #+anti-pp65. La presentation de ces peptides etait inhibee par un pretraitement des cellules cibles par la chloroquine. Ceci suggere que ces produits necessitent un appretement dans un compartiment cellulaire acide avant d'etre presente par les molecules hla de classe i. Des formulations synthetiques comme celles que nous proposons permettraient d'eviter les risques lies a l'utilisation de souches virales attenuees. Elles pourraient etre utilisees dans des protocoles de vaccination a visee immunoprophylactique au sein de populations a risques (femmes seronegatives, transfert de cellules apres greffes)

Titre traduit

In vitro analysis of the cellular immune response t against human cytomegalovirus antigens under soluble or synthetic biovectors-associated forms

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