Etude fonctionnelle de deux recepteurs hematopoietiques a activite tyrosine kinase de classe iii : kit et flt3

par NATHALIE CASTERAN

Thèse de doctorat en Biologie moléculaire et cellulaire

Sous la direction de Patrice Dubreuil.

Soutenue en 1997

à Paris 7 .

mots clés

Résumé

Les recepteurs flt3 et kit appartiennent a la famille des recepteurs a activite tyrosine kinase de classe iii. Cette famille comprend egalement les recepteurs du pdgf et fms. Ils sont constitues d'une region extracellulaire, formee de 5 boucles de type immunoglobuline, d'une region transmembranaire et d'une partie cytoplasmique contenant un domaine kinase interrompu par une region hydrophile, la region interkinase. Flt3 et kit sont exprimes dans les cellules hematopoietiques precoces et ont aussi un role plus tardif dans la differenciation : au niveau des pre-b pour le recepteur flt3 au niveau de la differenciation mastocytaire pour le recepteur kit. Le recepteur murin flt3 a ete clone en 1992. La construction d'un recepteur chimerique comprenant la partie extracellulaire du recepteur pour le csf1 (fms) fusionnee aux domaines intracytoplasmiques de flt3 a permis en l'absence de son ligand de le stimuler par le ligand csf1. Cette chimere exprimee dans differentes lignees cellulaires nous a permis d'obtenir une reponse mitogenique en presence de csf1 et d'etudier les signaux de transduction actives par flt3. Ainsi p85 de la pi3k et grb2 sont associes au recepteur et gap, shc et vav sont phosphoryles mais non associes. Nous avons determine la sequence de fixation de la pi3k : la tyrosine 958. Le recepteur mute pour la tyrosine 958 (substitution en phenylalanine) ne fixe plus la p85 de la pi3k mais n'affecte ni la mitogenicite ni l'internalisation du recepteur. L'expression de la chimere dans des cellules mastocytaires w/w (deficientes dans l'expression du recepteur kit) reconstitue la mitogenicite et la maturation de ces cellules. Cependant, elle ne permet pas l'adhesion a la fibronectine qui reste une fonction specifique de kit. Flt3 semble donc partager des substrats communs a la transduction du signal de kit. Le gene c-kit code pour 2 isoformes kit#s (pour kit short) et kit#l (pour kit long) qui different dans la partie extracellulaire, a proximite de la membrane, par l'addition de 4 acides amines supplementaires pour la forme longue. L'expression de ces 2 isoformes dans les lignees cellulaires ba/f3 et rat 2 et l'etude de ces cellules a mis en evidence une difference de mitogenicite, d'internalisation et de routage cellulaire des 2 recepteurs apres activation. Kit#s a une hypersensibilite au ligand, internalise rapidement et completement, et co-localise avec les lysosomes apres activation. Kit#l est moins sensible au ligand que kit#s, internalise moins rapidement et partiellement. Cette expression residuelle pourrait correspondre a un recyclage du recepteur puisque cette isoforme est retrouvee co-localisee avec les endosomes apres activation. Au cours des cultures de populations ba/f3 infectees par les 2 isoformes de kit, nous avons obtenu une population kit#s independante du ligand dans sa croissance. Le sequencage de la sequence codante a permis de mettre en evidence une deletion de 9 acides amines. La reproduction de cette deletion dans le plasmide retroviral et son introduction dans les lignees cellulaires rat 2 et ba/f3 permet d'observer une capacite transformante in vitro et in vivo des populations exprimant kit#sd.

Titre traduit

Functional study of two hematopoietic receptors with tyrosine kinase activity : kit and flt3

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