Elaboration de couches bioactives associées à un capteur optique : compartimentation de séquences tri-enzymatiques et libération interne contrôlée de co-réactifs

par Philippe E. Michel

Thèse de doctorat en Sciences. Génie biologique et médical

Sous la direction de Loïc Blum.

Soutenue en 1997

à Lyon 1 .

Le jury était composé de Loïc Blum.

mots clés

• Fibres optiques
• Bioluminescence
• Enzymes immobilisées
• Biocapteurs
• Oxydoréductases

Résumé

La configuration de la couche sensible est un point determinant dans la conception des biocapteurs. Son amelioration a ete envisagee suivant deux approches en utilisant pour modele un capteur de bioluminescence a fibres optiques : d'une part la compartimentation de couches sensibles multi-enzymatiques sequentielles, consistant a immobiliser les differentes enzymes sur des supports differents, d'autre part le developpement de couches sensibles integrant les enzymes et les co-reactifs. Les phenomenes relatifs a la compartimentation ont ete etudies en associant des deshydrogenases nad-dependantes (lactate- ou sorbitol deshydrogenase) au systeme luminescent bacterien oxydoreductase-luciferase. Une surconcentration de l'intermediaire commun des sequences enzymatiques a ete mise en evidence du fait de la compartimentation. Ainsi, l'utilisation de systemes compartimentes se traduit par une augmentation de la vitesse globale des reactions par rapport a celle obtenue avec la couche sensible co-immobilisee. Le controle des activites des systemes compartimentes a permis d'amplifier la sensibilite des mesures dans le cas de la lactate- et de la sorbitol deshydrogenase par des facteurs respectivement voisins de 5 et 14. Les potentialites offertes par la compartimentation ont ete exploitees pour la mise au point d'une couche sensible integrant la sequence adenylate kinase - creatine kinase - luciferase de luciole et permettant les dosages alternes d'atp, d'adp et d'amp. Pour ajouter un niveau d'organisation plus complexe a la couche sensible, le co-substrat de la luciferase de luciole, la luciferine, a ete confine dans une matrice synthetique. La cinetique de liberation du substrat a ete etudiee en associant la matrice-luciferine a une membrane de luciferase. L'association de cette matrice au biocapteur a amp, adp et atp a permis la mise au point d'un systeme semi-autonome dont l'autonomie est estimee a 3 heures de fonctionnement continu.

Titre traduit

Bioactive layers for fiberoptic bioluminescence sensors : compartmentalization of tri-enzymatic sequences and internal release of co-reactants

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