Glycoprotéine-P de résistance aux drogues chimiothérapiques : fixation d'ATP et d'agents chimio-sensibilisants sur les domaines cytoplasmiques obtenus sous forme recombinante et purifiée

par Giula Oiknine

Thèse de doctorat en Sciences. Biochimie

Sous la direction de Attilio Di Pietro.

Soutenue en 1997

à Lyon 1 .

Le jury était composé de Attilio Di Pietro.

mots clés

• Glycoprotéine P
• ATP
• Flavonoïdes
• Stéroïdes
• Protéines recombinées
• Phénotype

Résumé

La glycoproteine-p est un transporteur de la membrane plasmique code par le gene mdr 1 et surexprime dans des cellules cancereuses traitees par des drogues chimiotherapiques. Elle rejette ces drogues en utilisant l'hydrolyse d'atp comme source d'energie et confere le phenotype cellulaire mdr (multidrug resistance). La glycoproteine-p est constituee de deux moities homologues contenant chacune un domaine transmembranaire implique dans le transport des drogues, et un domaine cytoplasmique responsable de la fixation et l'hydrolyse de l'atp, et reliees entre elles par un domaine linker phosphorylable par les proteine kinases. La faible abondance de la glycoproteine-p dans les cellules normales et son caractere membranaire rendent difficiles sa purification et son etude biochimique. Nous avons choisi d'etudier son mecanisme moleculaire en surproduisant sous forme soluble, par genie genetique, les deux domaines cytoplasmiques afin de caracteriser leurs interactions avec l'atp et avec divers substrats destines ou non a etre transportes. Les limites des deux domaines nucleotidiques sont determinees par predictions de structure et comparaison avec d'autre proteines fixatrices d'atp dont la structure tridimensionnelle est connue. Les adn complementaires correspondants sont prepares et inclus dans des vecteurs d'expression. Les differents domaines sont surproduits dans escherichia coli, en fusion avec la glutathion s-transferase ou un hexapeptide d'histidines, puis purifies par chromatographie d'affinite. Le domaine c-terminal, ou nbd2, contient un seul residu tryptophane, situe strategiquement et possedant un environnement relativement hydrophobe. Sa fluorescence est attenuee par interaction avec l'atp, ainsi que l'adp ou le gtp et leurs derives fluorescents de type 2',3'-o-(2,4,6-trinitrophenyl)- et 2'(3')-n-methylanthraniloyl-. Le domaine n-terminal, ou nbd1, possede un seul residu cysteine situe dans une boucle riche en glycines liant la chaine phosphate du nucleotide. Sa modification chimique inhibe la fixation d'analogues fluorescents de l'atp, le photomarquage par le 8-azido-atp, ainsi que l'activite d'hydrolyse de l'atp. L'allongement de nbd1 du cote c-terminal aboutit au domaine nbd1-linker possedant un seul residu tryptophane dans une region tres hydrophobe. Sa fluorescence permet de detecter une fixation a haute affinite pour les flavonoides et pour les hormones steroides, deux classes d'agents chimio-sensibilisants connus pour moduler le transport des drogues dans des cellules de phenotype mdr. L'etude d'une serie d'effecteurs nous permet d'etablir des relations entre leur structure et leur activite. Le site de fixation des agents chimio-sensibilisants apparait tres hydrophobe et localise a proximite immediate du site de fixation de l'atp. Ce site pourrait constituer une premiere etape de reconnaissance des agents chimio-sensibilisants et des drogues chimiotherapiques, precedant leur transport eventuel par le domaine transmembranaire de la glycoproteine-p.

Titre traduit

P-glycoprotein responsable for cellular multidrug resistance : binding of atp and of chemo-sensitizing agents to recombinant and purified soluble cytosolic domains

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