Transfert de gene chez des mollusques bivalves : constructions, transfections et analyses fonctionnelles de vecteurs d'expression

par Jean-Paul Cadoret

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Yves Benyamin.

Soutenue en 1997

à Paris, EPHE .

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Résumé

A l'instar de nombreux exemples, la transformation genetique pourrait permettre d'aborder sous un angle neuf les strategies de lutte contre les agents infectieux qui affectent les productions conchylicoles. Les outils de biologie moleculaire permettent d'envisager une intervention ciblee sur le genome de invertebres marins ouvrant egalement des possibilites inedites d'etudes en recherche fondamentale. Le transfert de gene a l'interieur d'un ovocyte, d'une larve ou d'un embryon d'huitre ou de moule necessite la mise au point de techniques de transfection et la disponibilite de constructions genetiques fonctionnelles. Nous avons entrepris de mettre au point en l'adaptant, une technique de microinjection pour laquelle nous avons realise les outils indispensables. Parallelement une technique complementaire de bombardement de particules d'or recouvertes de l'adn a transfecter a ete mise au point. Ces deux techniques ont ete mises en oeuvre pour tester deux promoteurs heterologues, le promoteur de la proteine de choc thermique (hsp70) de la drosophile, couplee aux genes rapporteur luciferase et -galactosidase et le promoteur precoce du cytomegalovirus humain (cmv) en amont des memes genes rapporteurs. Ces vecteurs d'expression se sont montres efficaces quant a leur capacite a promouvoir l'expression transitoire lors de transfections in vivo. Nous disposons ainsi de deux promoteurs complementaires, l'un inductible (hsp70), l'autre constitutif (cmv) utilisable comme outil de reference. L'identification de regions regulatrices de genes de ces bivalves a de plus ete entreprise. Les sequences completes d'un adn complementaire de l'actine ont ete identifiees chez l'huitre crassostrea gigas et la moule mytilus galloprovincialis. Par le biais de ces genes d'actine, nous avons ete en mesure d'isoler des sequences regulatrices permettant de creer des vecteurs d'expression originaux. La construction comportant le promoteur d'actine d'huitre couplee au gene de la luciferase s'est revelee fonctionnelle lors d'experiences de transfection in vitro. Ce sont les premiers promoteurs homologues de genes de bivalves utilises en transformation genetique.

Titre traduit

Gene transfer in bivalve molluscs : constructions, transfections and functional analysis of expression vectors

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