Thèse soutenue

Mise au point de sondes ADN pour la détection et la caractérisation des rhizobium : application à l'isolement à partir du sol des rhizobium symbiotes du haricot
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Auteur / Autrice : Valérie Macheret
Direction : Noëlle Amarger
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie des populations et des écosystèmes
Date : Soutenance en 1997
Etablissement(s) : Dijon

Mots clés

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Mots clés contrôlés

Résumé

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Pour améliorer les connaissances sur l'écologie de rhizobium, il est nécessaire d'étudier les populations isolées à partir du sol en évitant le biais lié à l'utilisation de la plante-hôte. Néanmoins, l'étude des populations naturelles du sol présente une difficulté d'ordre méthodologique, qui est l'isolement direct à partir du sol, faute de milieu de culture spécifique. Les isolements réalisés récemment ont été possibles grâce à la mise au point de milieux semi-sélectifs augmentant la proportion de rhizobium par rapport à la microflore totale cultivable et de sondes nucléiques pour la détection des espèces. Des outils à la fois universels pour tous les rhizobium tout en étant spécifiques de ce groupe de micro-organismes taxonomiquement et phylogénétiquement hétérogènes ne sont cependant pas disponibles. De même, peu d'outils spécifiques d'espèces de rhizobium particulières ont été actuellement décrits. La mise au point de tels outils moléculaires a constitué l'un des objectifs de cette étude. Nous avons développé d'une part une sonde nucléique, nodD, capable de détecter les souches représentant les différents genres et espèces de rhizobium. D'autre part, des sondes oligonucléotidiques ont été définies pour chacune des espèces nodulant le haricot, R. Gallicum, R. Giardinii, R. Etli, R. Leguminosarum, R. Tropici iia et R. Tropici IIB par comparaison des séquences d'Adn 16S de rhizobium et de genres bactériens phylogénétiquement proches. Un préliminaire à cette étude a été la détermination des séquences d'Adnr 16S qui n'étaient pas disponibles pour les espèces R. Gallicum et R. Giardinii. Ces travaux ont permis de préciser leur position phylogénétique au sein du genre rhizobium. Les oligosondes ainsi définies se sont révélées spécifiques par hybridation de colonies pour chacune des différentes espèces symbiotes du haricot. L'utilisation conjointe de milieux de culture semi-sélectifs, de procédure de contre-sélection sur milieu de culture et des sondes moléculaires ont permis, d'une part l'isolement de sols de culture de communautés de rhizobium de spécificité d'hôte a priori inconnue, d'espèces potentiellement capables de noduler le haricot, R. Leguminosarum bv. Phaseoli et R. Giardinii, de souches de R. Leguminosarum bv. Viciae et de bactéries phylogénétiquement apparentées aux rhizobium, mais également une part importante de R. Leguminosarum dépourvus d'information symbiotique. Les oligosondes ont également permis de détecter et d'isoler les espèces R. Etli, R. Tropici et R. Gallicum dans des échantillons de sol de parcelles inoculées avec ces espèces, démontrant ainsi la spécificité des outils moléculaires mis au point. Nous avons néanmoins démontré les limites de cette approche pour la quantification des bactéries : instabilité des plasmides symbiotiques chez R. Leguminosarum bv. Phaseoli au cours du procédé d'isolement, et phénomènes d'inhibition de la multiplication des cellules en culture.