Criblage par dosage immunochimique de souches recombinantes chez penicillium roquefortii

par EMMANUELLE DULAC-BRACQ

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Jean-Paul Larpent.

Soutenue en 1997

à Clermont-Ferrand 2 .

mots clés

Résumé

Afin de proposer un choix plus important de souches de p. Roquefortii la technique de fusion de protoplastes a ete utilise et le criblage des souches recombinantes a ete realise par le dosage elisa de l'aspartyl proteinase de ce champignon. Le developpement de ce dosage elisa de type sandwich a necessite la purification de l'enzyme (utilisation successive d'une colonne mono q et d'une colonne superdex 75 ou d'un gel sephadex g100 superfine). La purete de l'enzyme et la specificite des anticorps obtenus ont permis le developpement d'un sandwich elisa tres sensible (0,25 ng/ml), reproductible (cv=3-7%), presentant un taux de recuperation superieur a 98% et une excellente correlation (r=0,995) avec le dosage enzymatique a ph acide. Les conditions optimales de culture ont ensuite ete definies (ph et source de proteine : caseine ou trypticase). La synthese d'aspartyl proteinase est favorisee par les cultures a ph 4,0 contenant du trypticase. Par contre, l'activite specifique de l'enzyme est maximale lorsqu'elle est produite dans une culture a ph 6,0. Les cultures realisees sur czapek trypticase tamponne a ph 4,0, associees au dosage elisa de l'aspartyl proteinase ont permis un criblage simple des souches de p. Roquefortii (50 cultures et 100 dosages en simultane) et reproductible (cv=12,5%). Le croisement a debute par le marquage des souches parentales : l'irradiation aux uv a fourni principalement des mutants biochimiques. La fusion de protoplastes ensuite a permis l'obtention de 2000 colonies. Apres fusion nucleaire puis haploidisation, 300 recombinants ont ete selectionnes et 180 ont pu ensuite rapidement etre caracterises a l'aide du test de criblage. Le tri des recombinants en fonction de leur aspect, de leur croissance et de leur synthese d'aspartyl proteinase a ete realise. 50% des souches presentent des proprietes differentes des parents et l'ecart entre les niveaux extremes de synthese d'aspartyl proteinase a ete multiplie par 10 par la recombinaison.

Titre traduit

Screening by immunochemical quantitation of recombinant strains of penicillium roquefortii

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