Optimisation de la spécificité d'anticorps anti-stéroïde par mutagenèse semi-rationnelle du site de liaison

Optimisation of anti-steroid antibody specificity using binding-site mutagenesis

• Auteur / Autrice : Patrick Chames
• Direction : Daniel Baty
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et microbiologie
• Date : Soutenance en 1997
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université d'Aix-Marseille II. Faculté des sciences (1969-2011)

Résumé

L'ingenierie des anticorps permet de modifier et d'ameliorer les caracteristiques d'anticorps monoclonaux. Nous avons exploite ces nouvelles techniques afin d'obtenir des anticorps anti-steroides specifiques, tres difficiles a obtenir par la technique des hybridomes. La mise au point de ces methodes nous a de plus permis de developper quelques sujets annexes : la premiere partie de ce travail est consacree a la production d'un fragment d'anticorps anticortisol produit de facon insoluble chez e. Coli. L'utilisation d'une fusion traductionnelle avec la proteine affine du maltose (mbp) et d'une souche mutante d'e. Coli dont la membrane alteree permet une fuite des proteines periplasmiques dans le milieu de culture nous a permis d'atteindre un taux d'expression typique des fragments d'anticorps. La seconde partie de ce travail vise a apporter de nouvelles solutions au domaine des anticorps bispecifiques utilises pour les traitements de cancers. Nous avons exprime chez e. Coli un fragment fab d'un anticorps anti-dtpa, une petite molecule capable de complexer divers ions utilises en immunoscintigraphie ou en immunotherapie. Ce travail represente le premier pas vers l'obtention d'anticorps bispecifiques recombinants utilisables dans le domaine de la sante. Le troisieme volet decrit l'utilisation d'un fragment d'anticorps anti-colicine a, une toxine bacterienne, comme outil d'etude fondamentale. La protection d'e. Coli contre l'action de cette toxine, par blocage de cette proteine in vivo, a permis de demontrer la presence de la partie n-terminale de la toxine dans le periplasme de la bacterie pendant la formation du pore membranaire. Ceci demontre aussi qu'un fragment d'anticorps peut etre actif dans les conditions extremes rencontrees dans le periplasme de la bacterie. Enfin la majeure partie de ce travail concerne l'amelioration des caracteristiques d'un anticorps anti-cortisol. Nous avons tout d'abord clone le fragment scfv de cet anticorps (domaine vh relie au domaine vl par un peptide flexible) afin de pouvoir l'exprimer a la surface de phages filamenteux. En utilisant des informations obtenues grace a un modele moleculaire et a une analyse des structures de complexes anticorps-haptene, nous avons degenere certaines positions du paratope de cet anticorps anti-cortisol de facon a obtenir une banque de variants de l'anticorps de depart. Cette banque a ete utilisee pour selectionner de nouveaux anticorps possedant une nouvelle specificite (anti-estradiol a partir de l'anti-cortisol) ou de meilleures caracteristiques. Pour ces derniers, nous avons obtenu des anticorps anti-cortisol jusqu'a 20 fois plus affins et jusqu'a 8 fois plus specifiques que l'anticorps de depart. L'ingenierie des anticorps represente une solution de choix pour obtenir des anticorps de haute specificite indispensable au dosage des steroides.