Approche biophysicochimique du transfert direct d'ADN dans des cellules et des tissus végétaux intacts par électroperméabilisation

par Nai͏̈ma Sabri

Thèse de doctorat en Biologie moléculaire et cellulaire végétale

Sous la direction de Justin Teissié.

Soutenue en 1996

à Toulouse 3 .

mots clés

Résumé

Le developpement des techniques de transgenese a permis de lever les limites associees aux voies classiques impliquant les croisements naturels. Elles permettent en effet de modifier une espece vegetale de telle sorte qu'elle ne differe de l'espece parentale que par la presence d'un gene donne qui peut appartenir a n'importe quel type d'organisme. Se trouvent ainsi franchies les barrieres d'especes et maintenu le fond genetique a l'exception du ou des genes transferes. Ceci n'est pas le cas des methodes classiques qui impliquant les processus sexuels, seuls des genes de la meme espece sont ainsi retenus et cela dans un contexte genique a chaque fois different et non determine. L'etude presentee s'inscrit dans le cadre de la transgenese vegetale en utilisant des systemes intactes et l'electrotransformation comme methodologie. La cellule selectivement isolee du milieu extracellulaire maintient de part et d'autre de sa membrane plasmique une difference de potentiel. L'application d'un champ electrique externe (electropulsation) a une suspension cellulaire induit un etat permeable non selectif, transitoire et reversible dans des conditions de champ electrique respectant la viabilite des cellules electropulsees (electropermeabilisation). Cet etat permeable permet de surmonter cette barriere de permeabilite membranaire selective et le passage de petites molecules independamment de la nature du milieu d'electropulsation. Par contre, l'electrotransfert d'adn necessite la plasmolyse des cellules en presence du plasmide a transferer avant l'electropermeabilisation. Nous obtenons par cette double procedure, plasmolyse et permeabilisation, la transformation de cellules intactes aussi bien somatiques (suspension cellulaire de mais) qu'embryonnaire (embryons immatures de mais et cals embryogenes de soja). D'un autre cote, l'electropermeabilisation des cellules declenche une reaction de stress qui se manifeste par une generation d'especes oxygenees reactives. Nous proposons un modele mettant en jeu une cascade d'evenements similaire a celle induite lors d'une attaque de la plante par un pathogene, et qui est declenchee par l'electropermeabilisation aux ions calcium. Si la generation de ces especes oxygenees reactives ne presente pas un effet dominant dans la mortalite cellulaire electroinduite, leur piegeage par les molecules antioxydantes tel que l'ascorbate a pour effet d'ameliorer le taux d'electrotransformation

Titre traduit

Biophysical and biochemical approach to dna transfer into intact plant cells and tissues mediated by electropermeabilization

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