Topographie intramembranaire de neuropeptides : quelques approches membranaires

par Sophie Augé

Thèse de doctorat en Biochimie et biophysique

Sous la direction de Alain Milon.

Soutenue en 1996

à Toulouse 3 .

mots clés

• Neuropeptides
• Tachykinines
• Liposomes
• Membranes (technologie)
• Substance P
• Spectroscopie de la résonance magnétique nucléaire
• Overhauser, Effet (physique nucléaire)

Résumé

La conformation membranaire d'un neuropeptide peut etre determinee par la technique rmn de l'effet overhauser nucleaire transfere (trnoe), a partir du peptide en interaction avec des liposomes constitues de phospholipides perdeuteries. Une souche de levure methylotrophe, pichia angusta, a ete adaptee a la croissance en milieu perdeuterie. Ceci a permis d'isoler des phospholipides (130 mg), des glycolipides et de l'ergosterol (30 mg) perdeuteries a 97,5%, a partir d'une culture en fermenteur de 1,5 l (24 gde matiere seche). L'etude de la neurokinine a (nka) par trnoe a ete entreprise apres l'attribution des deplacements chimiques. La nka n'interagit pas avec des liposomes neutres. Par contre, l'interaction entre le peptide et des liposomes charges negativement (phosphatidylglycerol (pg) entre 0,1% et 30% molaire) se traduit par un elargissement des raies du spectre rmn et une precipitation du complexe peptides-lipides. Cette interaction s'est averee etre trop forte pour observer des trnoe, ceci meme en presence de liposomes contenant 0,1% de pg. L'orientation de la substance p (sp) par rapport a la membrane a ete determinee par rmn solide de l'azote-15. La sp a ete marquee au #1#5n sur la phe#7 et la phe#8. Apres mise au point d'un nouveau protocole d'obtention de bicouches lipidiques orientees (caracterisees par la rmn-#2h et la rmn-#3#1p), les deplacements chimiques #1#5n ont ete mesures et montrent que la sp n'est pas structuree en helice inseree perpendiculairement au plan de la membrane. Une technique rmn a ete developpee afin de localiser un peptide dans une membrane. Elle repose sur l'observation de trnoe heteronucleaires intermoleculaires, entre le fluor du 6-fluoro-cholesterol et les protons du peptide. Les resultats preliminaires montrent la faisabilite de cette approche qui necessite cependant d'utiliser du 6-fluoro cholesterol deuterie au voisinage du fluor afin de limiter la diffusion de spins

Titre traduit

Intramembrane topology of neuropeptides: some nmr approaches

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