Etude du mécanisme de transposition de la séquence d'insertion IS1 chez Escherichia coli

par Catherine Turlan

Thèse de doctorat en Génétique moléculaire

Sous la direction de Mick Chandler.

Soutenue en 1996

à Toulouse 3 .

mots clés

• Séquençage des acides nucléiques
• Translocation (génétique)
• Recombinaison génétique
• Escherichia coli -- Génétique
• Transposons

Résumé

La transposition reflete une recombinaison illegitime mediee par des sequences d'adn capables de mobilite. Ces sequences (elements transposables) sont de nature tres diverse et sont largement representees, chez les organismes procaryotes, par les sequences d'insertion. Is1 est une sequence d'insertion commune a de nombreuses enterobacteries. De par sa translocation, elle est largement impliquee dans les remaniements genomiques chromosomiques et extrachromosomiques. Mon travail a consiste en l'etude du mecanisme de ces remaniements. Is1 medie des evenements de transposition intramoleculaire (deletion adjacente, excision - deletion) et intermoleculaires (cointegration, insertion simple). Les methodes de genetique classiques utilisees jusqu'alors n'ont permis que la mise en evidence des produits transpositionnels stables in vivo. L'impossibilite de detecter certains derives transpositionnels est un obstacle majeur a la comprehension du mecanisme de transposition d'is1. Dans un premier temps, nous avons donc elabore un systeme experimental qui permet la caracterisation in vivo de l'ensemble des intermediaires et produits transpositionnels (chapitre i). Ainsi, nous avons pu montrer que les deletions adjacentes promues par is1 resultent d'une transposition intramoleculaire de type duplicatif. Par ailleurs, nos travaux mettent en evidence l'aptitude d'is1 a se circulariser de maniere precise. Ce systeme experimental a egalement permis d'acceder de maniere statistique au ciblage de la transposition d'is1. Il devrait ainsi etre possible de comprendre le determinisme du choix de la cible par le complexe transpositionnel. La definition du mecanisme de translocation d'is1 a ensuite ete abordee par etude de l'enzyme qui catalyse la recombinaison transpositionnelle: la transposase insab' (chapitre ii). Insab' n'exhibe aucun des motifs catalytiques caracteristiques des transposases des autres sequences d'insertion connues a ce jour. En revanche, elle presente des motifs homologues aux motifs catalytiques des integrases de type lambdoide. La mutagenese des residus hautement conserves au sein de ces motifs montre leur implication (directe ou indirecte) dans la catalyse de la transposition d'is1. En parallele, nous avons elabore des tests d'activite in vivo d'insab' permettant d'isoler des transposases mutantes partiellement ou totalement defectives. L'analyse de ces mutants rendra possible la definition des domaines proteiques essentiels au processus transpositionnel. En outre, toute transposase deficiente pour l'une ou l'autre des etapes de la mobilisation d'is1 conduira a l'accumulation d'intermediaires reactionnels. Ainsi, ces differentes etapes pourront etre analysees et chacune d'elles pourra etre associee a une activite catalytique de la transposase d'is1. Enfin, pour affiner encore l'analyse de ce mecanisme, nous avons realise les experiences preliminaires a la reconstitution in vitro de la transposition d'is1 (chapitre iii). Insab' a ete exprime chez e. Coli puis enrichie ou synthetisee au sein du systeme acellulaire. Divers tests permettant de detecter les evenements de transposition in vitro ont ete mis au point. Des resultats encourageants ont ete obtenus mais ceux-ci doivent etre completes par une analyse approfondie de l'activite de la transposase in vitro. Les travaux presentes dans ce memoire permettent d'ores et deja une meilleure apprehension du role et de la nature des partenaires nucleiques et proteiques, du ciblage de l'insertion et du mecanisme de transposition d'is1. Ainsi, la simplicite de son organisation genetique et la diversite des evenements transpositionnels qu'elle promeut font d'is1 un systeme d'etude original donnant acces aux multiples parametres du processus transpositionnel

Titre traduit

Study of transposition mechanism of insertion sequence is1 in e. Coli

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