La creatine kinase du spermatozoide de truite arc-en-ciel (oncorhynchus mykiss). Aspects biochimiques et moleculaires. Localisation dans le gamete et participation a son metabolisme energetique

par CHRISTELE SAUDRAIS

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de M. LOIR.

Soutenue en 1996

à Rennes 1 .

mots clés

Résumé

L'enzyme creatine kinase (ck ; atp: creatine n-phosphoryl-transferase, ec 2. 7. 3. 2), permet de generer de l'atp a partir du transfert reversible du groupe phosphate de la phosphocreatine (pc) vers l'adp. Le spermatozoide de la truite arc-en-ciel (oncorhynchus mykiss) possede une activite ck importante (16,5 7,6 ui/mg ; 37,04 9,6 ui/10#9 spermatozoides). La purification de la ck a partir des spermatozoides de truite (sck) par cavitation des cellules a l'azote, puis par 2 etapes successives de chromatographie (deae-trisacryl et blue sepharose), l'obtention d'un immunserum de lapin dirige contre la sck, et la fourniture par a. Garber et g. Dixon de l'adnc tck1 codant pour une ck du testicule de truite (garber et al. , 1990), ont permis de disposer d'outils pour la caracterisation de l'enzyme et l'etude de l'expression du gene dans les cellules germinales au cours de la spermatogenese. Nous n'avons detecte qu'une seule isoforme de ck dans le spermatozoide de truite, de nature dimerique, d'un poids moleculaire de 86 kda, codee par l'adnc tck1. Plusieurs travaux (comportement de la sck vis a vis du triton x-114, immunofluorescence, immunogold, fractionnement cellulaire) suggerent que l'enzyme a une localisation subcellulaire essentiellement cytosolique. L'expression du gene codant pour la sck a ete etudiee par hybridation in situ (riboprobes marques a la fluoresceine) sur coupes de testicules. L'arnm du gene est visualise dans les spermatocytes primaires et secondaires, et dans les spermatides jeunes. La presence de la proteine sck a ete mise en evidence par immunocytologie sur coupes de differents organes de truite, uniquement dans le testicule, et plus precisement dans les spermatides agees et dans les spermatozoides. La sck est donc une proteine cellule germinale-specifique ; la transcription du gene a lieu dans les cellules germinales meiotiques tandis que la traduction de l'arnm commence dans les cellules haploides. Le role de la ck a ete envisage dans l'energetique de la motilite du spermatozoide ; le systeme ck/pc pourrait intervenir dans les mecanismes par lesquels l'atp parvient aux dyneine-atpases de l'axoneme, au niveau desquelles l'energie chimique, sous forme d'atp, est convertie en energie mecanique. L'analyse des phosphonucleotides et de la pc dans des extraits de spermatozoides mobiles, par resonance magnetique nucleaire (rmn) du #3#1p, montre un epuisement partiel de l'atp et de l'adp, total de la pc, au bout de 35 sec d'activite (4c). L'utilisation de l'inhibiteur enzymatique dnfb n'a pas permis de modifier de facon specifique la motilite des spermatozoides en conditions in vivo ; en revanche, en conditions ex vivo, la motilite des spermatozoides, et notamment la frequence de battement flagellaire, est sous la dependance de l'activite enzymatique de la ck ainsi que de l'adenylate kinase (adk: permet de generer de l'atp a partir du transfert reversible d'un groupe phosphate d'un adp vers un autre adp). Cependant, au cours de cette etude, la participation effective de la ck a la motilite du gamete n'a pas ete etablie. Les mecanismes par lesquels l'atp parvient aux dyneine-atpases de l'axoneme pourraient dependre du mode de fecondation, interne ou externe, des poissons. La presence de la ck est suspectee dans les spermatozoides de brochet ; elle est demontree dans les spermatozoides de la carpe commune, du silure glane et du turbot, tous des poissons, comme la truite arc-en-ciel, a fecondation externe. En conclusion, cette etude a permis d'etudier l'expression d'un gene codant pour une proteine cytosolique au cours de la spermatogenese chez la truite arc-en-ciel, et d'aborder l'energetique de la motilite du spermatozoide par une voie originale

Titre traduit

Creatine kinase of spermatozoa of trout (oncorhynchus mykiss). Biochemical and molecular aspects. Localization in the gamete and implication in his energetical metabolism

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