Application de la maldi-ms a l'enzymologie moleculaire et a la chimie des proteines

Application of maldi-ms to molecular enzymology and protein chemistry

• Auteur / Autrice : SYLVIE GILLET
• Direction : C. HOUNTONDJI
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Paris 6

Résumé

La spectrometrie de masse est une methode rapide, fiable et precise, qui permet, entre autres, l'etude des modifications chimiques des proteines, en mesurant l'increment de masse apporte a une proteine ou a un peptide par la modification, en comparaison a la proteine ou au peptide temoins non-modifies. Ce travail decrit l'application de la spectrometrie de masse a desorption-ionisation laser assistee par matrice (maldi-ms) a l'identification des residus d'acides amines marques par des analogues reactifs de l'atp et de l'arnt, au site de liaison de ces substrats sur certaines enzymes de l'appareil traductionnel de la biosynthese des proteines. Dans le premier chapitre, le site de liaison de l'atp sur les lysyl- et histidyl-arnt synthetases, a ete etudie en utilisant des derives pyridoxyles de l'atp (plp, pldp, adp-pl et atp-pl) qui reagissent par leur fonction aldehyde avec la fonction amine primaire de la chaine laterale de residus lysines en formant une base de schiff. Un autre derive reactif de l'atp, le fluorosulfonylbenzoyl-adenosine (fsba), specifique des chaines laterales nucleophiles des acides amines polaires, a permis dans le cas de l'histidyl-arnt synthetase (hisrs), de rechercher des acides amines autres que les lysines au centre actif de cette synthetase de classe ii. Dans le deuxieme chapitre, le site de liaison du bras accepteur de l'arnt#f#m#e#t sur la methionyl-arnt#f#m#e#t transformylase, a ete etudie par le marquage covalent de cette enzyme par l'arnt#f#m#e#t-dialdehyde, un analogue de l'arnt#f#m#e#t rendu reactif par l'oxydation du groupement cis-diol du ribose de l'adenosine 3'-terminale. Dans le troisieme chapitre, nous nous sommes interesses a une modification post-traductionnelle auto-catalysee qui consiste en la fixation covalente de la methionine sur la methionyl-arnt synthetase, a partir d'un donneur methionyl-adenylate synthetise par l'enzyme elle-meme. Dans les structures cristallographiques disponibles des enzymes etudiees, la localisation de certains des residus marques au centre actif est compatible avec leur participation a la catalyse et/ou a la liaison du substrat. Par exemple, la lysine-118 de l'hisrs, majoritairement marquee par tous les analogues reactifs de l'atp etudies, est situee dans le motif 2, l'un des 3 motifs catalytiques caracteristiques des aminoacyl-arnt synthetases de la classe ii, a l'interieur de la crevasse du centre actif de cette enzyme