Production d'anticorps monoclonaux anti-alginate : surproduction, structure et activité des alginate lyases bactériennes AlxM et Algi en vue de la préparation d'un complexe anti-alginate contre Pseudomonas aeruginosa

par Frédéric Chavagnat

Thèse de doctorat en Sciences. Biochimie

Sous la direction de Micheline Guinand.

Soutenue en 1996

à Lyon 1 .

Le jury était composé de Micheline Guinand.

mots clés

• Pseudomonas aeruginosa
• Anticorps monoclonaux
• Alginates

Résumé

L'alginate, polymere d'acides mannronique et guluronique, est un facteur de virulence de pseudomonas aeruginosa. Il protege la bacterie de la phagocytose et de l'action des antibiotiques. Le but de mon travail etait d'obtenir des anticorps anti-alginate et de produire en grande quantite des alginate lyases actives sur l'alginate de p. Aeruginosa. Des anticorps monoclonaux igm anti-alginate ont ete obtenus par immunisation de souris avec un conjugue bsa/alginate de p. Aeruginosa. Ils ont ete purifies puis reduits en monomeres pour un couplage avec la peroxydase. Le conjugue fonctionnel obtenu a permis de valider la methode pour la synthese du conjugue alginate lyase/anticorps anti-alginate. L'alginate lyase alxm de la bacterie marine atcc 433367 a ete surproduite chez e. Coli et purifiee en une seule etape: sa masse est de 30 kda, le rendement de purification est de 90% (32 mg/l de culture). Les conditions optimales d'activite de alxm ont ete determinees, puis utilisees pour l'etude de sa specificite. Alxm est une mannuronate lyase, elle produit, par un mecanisme de -elimination avec retention de configuration, un oligomere de dp3 quel que soit le substrat. Ses parametres cinetiques ont ete determines pour des substrats oligomeriques de structure definie. Le gene algi codant pour l'alginate lyase produite par pseudomonas alginovora a ete amplifie par pcr directe et inverse, sequence puis clone dans le vecteur de surexpression pet-22b. L'enzyme surproduite a 18c dans e. Coli, algisur, a ete purifiee en une seule etape par chromatographie d'affinite avec un rendement de 67% (5 mg/l de culture). Conformement a la strategie de surexpression, sa masse de 24635 da correspond a celle de algi additionnee de la sequence poly(his). Algi et algisur ont le meme profil d'activite avec une specificite de type mannuronate lyase. Une etude par hca sur alxm, algi et quatre autres alginate lyases de structures primaires connues a permis de classer ces enzymes deux par deux en trois familles

Titre traduit

Anti-alginate monoclonal antibodies production ; overproduction, structure and activity of alxm and algi bacterial alginate lyases for the synthesis of an anti-alginate conjugate directed against pseudomonas aeruginosa

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