Détection des Brucella par immunofluorescence indirecte, ELISA par immunocapture et amplification en chaîne par polymérase : application au diagnostic des brucelloses animales

par Marisa da Costa

Thèse de doctorat en Sciences. Microbiologie

Sous la direction de Gérard Dubray.

Soutenue en 1996

à Lyon 1 .

Le jury était composé de Gérard Dubray.

mots clés

• Brucella
• Brucellose -- Chez les animaux
• PCR (génétique)
• Immunofluorescence
• ELISA

Résumé

Trois methodes permettant d'ameliorer le diagnostic direct des brucelloses animales a partir d'echantillons biologiques ont ete developpees: la technique d'amplification en chaine par polymerase (pcr), l'immunofluorescence indirecte (ifi) et l'elisa par immunocapture. L'utilisation des genes arn16s, bcsp31, dnaj, dnak, groel et htra comme cibles de la pcr a permis la detection de l'ensemble des especes et biovars du genre brucella ; aucune difference n'a ete retrouvee apres simple et double amplification, analyse de restriction des fragments amplifies et hybridation avec des sondes internes specifiques. Parmi les 98 microorganismes etudies, seuls ochrobactrum anthropi et phyllobacterium spp. , bacteries genetiquement proches des brucella, ont montre des similitudes sur certains de ces genes. L'etude realisee pour la detection des genes arn16s et bcsp31 dans des echantillons biologiques a montre une bonne specificite mais sa sensibilite s'est montree inferieure a celle de la bacteriologie classique. Les echantillons paucibacteriens ont ete les plus difficilement detectes ; leur inactivation prealable par la chaleur et les techniques d'extraction ont influence grandement cette sensibilite. La technique ifi realisee au moyen de serums polyclonaux anti-brucella, s'est averee moins sensible et moins specifique que la bacteriologie classique. La technique elisa par immunocapture au moyen d'anticorps monoclonaux et polyclonaux anti-lipopolyoside lisse (lps-s) a, quant a elle, montre une excellente specificite mais une sensibilite globale inferieure a celle de la bacteriologie classique. Des reactions positives avec les deux types d'anticorps utilises ont ete retrouvees avec les souches de yersinia enterocolitica o:9, dont le lps-s possede des epitopes communs avec celui des brucella. La bacteriologie classique reste donc la technique de reference en matiere de diagnostic direct des brucelloses animales. La pcr et l'elisa par immunocapture permettraient neanmoins, au prix d'ameliorations techniques, d'accelerer le diagnostic de la brucellose

Titre traduit

Detection of brucella spp. By indirect immunofluorescence, sandwich elisa and polymerase chain reaction. Aplication to the diagnosis of animals brucellosis

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