Caractérisation du mécanisme de détection du nickel et de transduction du signal chez Escherichia coli

= Mechanism of nickel detection and signal transduction in Escherichia coli

• Auteur / Autrice : Karinne de Pina-Seguin
• Direction : Long Fei Wu
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Lyon, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : LGMMIC - Laboratoire de Génétique Moléculaire des Microorganismes et des Interactions Cellulaires, UMR 5577 (Lyon, INSA1994-2000)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chimiotaxie

Hydrogenase

Anaérobiose

Résumé

Le nickel est un constituant essentiel des trois hydrogénases membranaires, indispensables à la croissance anaérobie d'Escherichia coli. Récemment, un système de transport spécifique du nickel, codé par l'opéron nik, a été mis en évidence au laboratoire. Il est constitué de cinq protéines présentant des homologies avec les composants des systèmes de transport bactériens de type ABC. NikA est la protéine périplasmique fixatrice du nickel. Nous avons surproduit et purifié la protéine NikA par chromatographie hydrophobe et échangeuse d'ions. Des études par spectrométrie de fluorescence intrinsèque de la protéine NikA et de dialyse en flux continu ont montré que le nickel se fixe, de façon spécifique, sur NikA avec une très forte affinité (Kd inférieur ou égal à 0,1 micro-molaire) et avec une stoechiométrie de 1/1. Nous avons également démontré l'implication de NikA dans chimiotactisme négatif vis-à-vis du nickel. Nous avons isolé, par insertion du transposon Tn10, un mutant touché au niveau du gène nikR qui code le répresseur du système de transport du nickel. Le gène nikR, situé en aval du locus nik, code une protéine de 15 kDa dont la séquence présente des homologies significatives avec les protéines Fur de diverses bactéries impliquées dans la régulation des systèmes de transport du fer. Le gène nikR a été inactivé sur plasmide par insertion d'une cassette uidA-kan, puis recombiné dans le chromosome. Le mutant ainsi obtenu présente une expression constitutive de NikA. Nous avons surproduit et partiellement purifié NikR par chromatographie d’affinité au nickel.

Nickel is an essential component of the three membrane-bound hydrogenases which are necessary for the anaerobic growth of Escherichia coli. Recently, a specific nickel uptake system, encoded by the nik operon has been described in our laboratory. It consists of five proteins homologous to the components of the bacterial ABC uptake systems. NikA is the periplasmic nickelbinding protein. We overproduced and purified NikA by hydrophobic and ion exchange chromatography. Quenching of intrinsic protein fluorescence and dialysis methods showed that NikA binds one atom of nickel per molecule of protein with high affinity (Kd less than 0. 1 micromolar). We also demonstrated the implication of NikA in chemotaxis away from nickel. The nik operon is negatively controlled by an excess of nickel. Using Tn10 transposon insertion mutagenesis, we isolated a mutant affected in the nikR gene which encodes the repressor for the specific nickel transport system. In this mutant, expression of the nik operon was no longer repressed. The nikR gene, located downstream the nik locus, directs the synthesis of a 15 kDa protein whose sequence presents significant homologies with the Fur proteins involved in the regulation of ferric uptake systems of various bacteria. The nikR gene was inactivated on a plasmid by insertion of an uidA-kan cassette, and then recombined into the chromosome. As expected, the mutant obtained expressed NikA constitutively. We overproduced and partially purified NikR by affinity nickel chromatography.