Etude du repliement de fragments de phosphoglycerate kinase de levure

par FREDERIC PECORARI

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Jeannine Yon-Kahn.

Soutenue en 1995

à Paris 11 .

mots clés

Résumé

La phosphoglycerate kinase de levure est un enzyme compose de deux domaines structuraux bien distincts. Il est generalement admis que les domaines sont des unites autonomes de repliement cooperatif, ce qui a ete confirme dans le cas de cet enzyme grace a l'obtention par voie genetique des domaines isoles. Cependant, les domaines de phosphoglycerate kinase de levure ne peuvent complementer ni de facon fonctionnelle, ni de facon structurale. Afin de determiner s'il existe d'une part des unites autonomes de repliement de taille inferieure a un domaine, et d'autre part les eventuelles conditions de complementation, nous avons developpe une methode de coupure chimique specifique des cysteines couplee a la mutagenese dirigee qui permet de choisir la position de coupure. Ayant la possibilite de choisir le point de coupure, nous avons pu rechercher a l'aide d'algorithmes les points de coupures pouvant generer des unites autonomes de repliement. Ainsi, nous avons obtenu et purifies environ quatorze fragments pour lesquels nous avons etudie la structure en utilisant plusieurs criteres: dichroisme circulaire, fluorescence et pontage chimique. Malgre l'absence de cooperativite pour le repliement des fragments de taille inferieure a un domaine structural, plusieurs fragments sont apparus comme des unites autonomes de repliement. Contrairement a l'idee generalement admise, les fragments qui complementent ne sont pas forcement ceux qui retrouvent, isoles, une structure quasi-native. Ceci suggere que, si les fragments isoles refletent la dynamique du repliement, le repliement des proteines ne peut etre necessairement considere comme l'association de sous-domaines prestructures d'apres ce que suggere le modele de la charpente. D'autre part, nous avons mis en evidence que les fragments n-terminaux de la phosphoglycerate kinase de levure correspondent a des intermediaires de repliement, ce qui montre que les fragments refletent bien la dynamique du repliement. Mais le plus inattendu de ces etudes a ete l'observation par pontage chimique pour cette proteine monomerique que ces intermediaires de repliement sont multimeriques. Ces etudes nous ont amene a la conclusion qu'il existe plusieurs chemins de repliement pour la phosphoglycerate kinase de levure dont certains impliquent des intermediaires de repliement multimeriques

Titre traduit

Folding studies of fragments from yeast phosphoglycerate kinase

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