Recherche et identification de residus de -agonistes. Methodes d'analyse par chromatographie gazeuse couplee a la spectrometrie de masse. Etude d'une reaction specifique avec le n,n-dimethylformamide dimethylacetal

par MARIE-PIERRE MONTRADE

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de François André.

Soutenue en 1995

à Nantes .

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Résumé

Cette etude qui s'inscrit dans le cadre du controle de l'utilisation illegale des -agonistes comme promoteurs de croissance en productions animales, presente une serie de travaux en spectrometrie de masse consacres a la recherche et a l'identification de leurs residus. Tout d'abord, une methode d'extraction et des modalites de detection et d'identification par chromatographie gazeuse couplee a la spectrometrie de masse (gc-ms) ont ete recherchees afin de pouvoir caracteriser (conformement aux criteres d'identification definis au niveau europeen) la presence de residus dans un prelevement d'urine. Dans le protocole retenu, a visee multi-residus, l'echantillon urinaire (ph 6,0) est extrait et purifie sur une phase mixte ; l'elution etant effectuee par un melange acetate d'ethyle: hydroxyde d'ammonium a 32% (97: 3, v/v). L'extrait est alors trimethylsilyle et analyse en gc-ms en mode impact electronique (ei) et en ionisation chimique positive (pci, methane). L'interet de derivations cycliques (de type 2-(dimethyl)silamorpholine ou methylboronique) qui apportent des informations structurales significatives en ei, est aussi presente. Au cours d'une premiere etude in vivo, de fortes doses de salbutamol ont ete administrees per os a des veaux pendant 7 jours. Les conditions optimales d'hydrolyse enzymatique des formes conjuguees du salbutamol ont ete recherchees et une methode d'extraction tissulaire combinant une extraction liquide/liquide (ph 9,8) a l'aide d'un melange acetate d'ethyle: isopropanol (60: 40, v/v) et une extraction purification sur phase mixte, a ete mise au point. Cette etude preliminaire a permis de constater l'elimination rapide de cette molecule et d'evaluer les limites des techniques d'analyse reposant sur l'utilisation d'un analyseur quadripolaire. Les resultats obtenus ont en effet montre que, meme en cas de surdosage, les residus de salbutamol deviennent difficiles a identifier dans les tissus apres une courte periode de retrait (7 jours). Aussi convenait-il d'ameliorer ces methodes afin de pouvoir augmenter le delai pendant lequel l'identification de residus reste possible. L'utilisation d'un spectrometre de masse a double focalisation et a geometrie inverse en fragmentometrie de masse haute resolution (hrsim) a permis d'atteindre cet objectif. La methode gc-ms hrsim mise en uvre (derives tms, ei, r 10 000), autorise l'identification de residus de clenbuterol presents a la concentration de 20 pg. G#-#1 dans des prelevements de muscle squelettique, apres 17 jours de sevrage d'un animal ayant recu 5 g. Kg#-#1. J#-#1 de clenbuterol pendant 15 jours (deuxieme etude in vivo). Enfin, en recherchant d'autres modalites de derivation, une reaction specifique avec le n,n-dimethylformamide dimethylacetal (dmf-dma) a ete mise en evidence. Des travaux en spectrometrie de masse ont permis d'analyser les mecanismes impliques ; l'etude de la formation de composes polaires et thermosensibles a ete facilitee par l'utilisation de l'ionisation par bombardement atomique rapide (fab). Il s'avere que la fonction amine secondaire du groupement ethanolamine des -agonistes se condense avec le dmf-dma pour donner un intermediaire ethanolamide. Des produits de reaction inedits, formes a temperature elevee par deshydratation de cet intermediaire, ont ete identifies. Il a aussi ete montre a partir d'un cas particulier (le salbutamol) que le dmf-dma peut reagir avec les alcools primaires. A cote de leur interet fondamental, ces observations pourraient etre exploitees pour elargir le champ du depistage (jusque-la limite aux 16 -agonistes etudies dans ce travail) et faciliter l'identification de nouveaux analogues. D'autres domaines d'application devraient egalement etre concernes par ces resultats

Titre traduit

Search and identification of -agonist residues. Methods of analysis by gas chromatography tandem mass spectrometry. Study of a specific reaction with n,n-dimethylformamide dimethylacetal

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