Purification de l'enzyme malique à NAD et étude du métabolisme du malate chez Eucalyptus citriodora en situation de contrainte saline

par Maria Erivalda Farias de Aragão

Thèse de doctorat en Biologie forestière

Sous la direction de Pierre Dizengremel.

Soutenue en 1995

à Nancy 1 , en partenariat avec Université Henri Poincaré Nancy 1. Faculté des sciences et techniques (autre partenaire) .

mots clés

• Malate
• Dehydrogenase
• Purification
• Hypocotyle
• Mitochondrie
• Caractérisation
• Cinétique
• Activité enzymatique
• Malate dehydrogenase
• Vigna unguiculata
• Eucalyptus
• Salinité

Résumé

L’enzyme malique à NAD (EM NAD) a été purifiée à partir d'hypocotyles Etoiles de Vigna unguiculata. Les étapes de purification de l'enzyme comportent : l'obtention de mitochondries purifiées, une chromatographie échangeuse d'ions (DEAE-cellulose) et deux chromatographies d'affinité (Blue-sepharose et CoA-agarose). L’enzyme purifiée est présente sous la forme dimérique, composée de deux sous-unités de masse moléculaire très proche (64 et 61 kDa). L’enzyme présente un mécanisme cinétique séquentiel au hasard et l'affinité pour chaque substrat augmente quand l'autre substrat est déjà lié à l'enzyme. L’enzyme est inhibée par les sels monovalents (NaCL, KCl et NaNO3) et par les produits de la réaction. Des anticorps polyclonaux, obtenus à partir de l'enzyme purifiée, ont été utilisés pour un suivi des modifications de l'enzyme en situation de contrainte saline. Pour cette deuxième partie, des plants d'Eucalyptus citriodora, âgés de 3 mois, sont cultivés en serre en ajoutant du NaCL (50 et 100 mm) à la solution nutritive. Les différences de croissance des plants ne sont observées qu'après 8 semaines de traitement. Cependant, dès la 3ème semaine, le sodium s'accumule dans les parties aériennes des plants traités alors que la teneur en potassium diminue. Ces phénomènes sont plus accentués pour le traitement NaCL 100 mm. Parallèlement, la teneur en acides aminés, en particulier en proline, augmente dans les feuilles, tandis que les teneurs en ions nitrates et en malate diminuent. Dans les feuilles des plants traites, les activités spécifiques des enzymes maliques (NAD et NADP) augmentent après 3 semaines de traitement, notamment avec NaCL 50 mm. L’étude immunologique a permis de montrer que l'augmentation de l'activité de L'EM NAD est associée à une augmentation de la quantité de protéine enzymatique. Par contre, pour l'EM NADP, l'augmentation de l'activité est plutôt associée à une forme plus active de la protéine

Titre traduit

NAD-malic enzyme purification and study of malate metabolism in Eucalyptus citriodora submitted to NaCL stress

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