Séparation d'immunoglobulines G à partir du sérum ou du plasma humain en utilisant le ligand L-histidine immobilisé sur des membranes à fibres creuses

par Sonia Maria Alves Bueno

Thèse de doctorat en Génie enzymatique, bioconversion et microbiologie

Sous la direction de Mookambeswaran A. Vijayalakshmi.

Soutenue en 1995

à Compiègne .

mots clés

• Membranes à fibres creuses
• Histidine
• Immunoglobuline G
• Affinité chimique
• Membranes (biologie)
• Plasma sanguin
• Purification
• Adsorption
• Séparation (technologie)
• Cinétique chimique
• Sérum-albumine

Résumé

Des membranes à fibres creuses ont été utilisé pour immobiliser le ligand histidine du fait de leur bon rapport surface membranaire/volume. Les membranes en PEVA se sont avéré le plus compatible. Ainsi, nous avons purifié les IgG sur le support Histidyl-PEVA fibres creuses dans une seule étape, à partir du sérum ou du plasma humain. La meilleure adsorption d'IgG sur ce support membranaire a été obtenue en présence d'ions de tampons zwitterioniques. Nous avons constaté que la sélectivité se manifeste au niveau des pl et des sous-classes des IgG. L'utilisation des tampons zwitterioniques ont permis de séparer la totalité de la fraction IgG du sérum, tandis que d'autres tampons ont permis l'adsorption sélective des IgG1 et des IgG3 ainsi que des IgG avec des points isoélectriques déterminés. Nous avons montré par la suite que l'adsorption des IgG humaine sur l'histidine se fait sur la partie Fab de la molécule. Nous avons également étudié quelques aspects cinétiques et de transfert de matière de ce système d'affinité. Cette étude a été essentielle pour le développement et l'optimisation du procédé de séparation d'IgG. La capacité de notre support en adsorber les IgG a été 3 à 8 fois supérieur à celle de la membrane à fibres creuses couplée à la protéine A décrite dans la littérature. Nous avons également envisagé d'appliquer notre système pour l'élimination des IgG des patients atteints de maladies immunitaires par circulation extracorporelle.

Titre traduit

Separation of Immunoglobulin G from human or plasma using immobilized L-histidine in hollow fiber membranes

Résumé

Previous work in our laboratory has shown that the amino acid histidine can be used a ligand for the purification of human immunoglobulin subclasses and monoclonal antibodies. Ln this work, we tried to combine the specificity of the ligand histidine with hollow fiber membrane technology to create a powerful device for the separation of IgG for human serum and for other sources. We chose poly( ethylene vinyl alcohol) (PEVA) hollow fibber membranes as the support material. The best IgG adsorption was obtained in presence of the zwitterionic buffers. By choosing the appropriate buffer system, it was possible to adsorb on membrane specifically different IgG subsets. For instance, in Mops buffer, IgG1, IgG2 and IgG3 were bound, whereas in Tris-HC1, only IgG3 and a part of the IgG1 fraction were retained. The parameters involved in the optimization of the separation process, namely the influence of residence time and serum and plasma dilution on immunoglobulin adsorption were studied in view of two applications: purification of IgG and removal of IgG from plasma in clinical aphaeresis (extracorporeal device). The capacity of Histidyl-PEVA calculated on the basis of unit membrane volume was 86 mg IgG/ml. Ln comparation of the protein A-membrane reported in literature, the capacity of Histidyl-PEVA was found to be 3 to 8 fold higher.