Etude des conditions expérimentales de la transformation génétique d'embryons zygotiques par Agrobacterium tumefaciens chez Arabidopsis thaliana L. Génotype C24 et essais d'extension à d'autres espèces végétales

par Yvan Bourgeois

Thèse de doctorat en Biotechnologie Végétale

Sous la direction de Brigitte S. Sangwan-Norreel.

Soutenue en 1995

à Amiens .

mots clés

• Embryon zygotique
• Plantes -- Biotechnologie
• Agrobacterium tumefaciens
• Arabidopsis thaliana
• Transformation génétique
• Plantes -- Ontogenèse
• Multiplication in vitro
• Plantes -- Régénération (biologie)

Résumé

Nous avons mis au point un protocole efficace de régénération chez Arabidopsis thaliana à partir d'embryons zygotiques immatures. Divers milieux de culture ont été testés. Des plantes morphologiquement normales et fertiles ont été régénérées à partir des cals issus des embryons mis en culture. Nous avons montré que l'efficacité de la régénération est maximale quand les embryons sont placés, tout d'abord, sur un milieu callogène à forte concentration en auxine et à faible concentration en cytokinine, puis transférés sur un milieu organogène à forte concentration en cytokinine et à faible concentration en auxine. Dans ces conditions, les taux de régénération obtenus sont supérieurs à 85%. Des analyses en cytofluorimétrie de flux ont montré que les plantes régénérées à partir de ce protocole étaient à plus de 95% diploïdes. L'efficacité du protocole de régénération mis en place nous a permis, par la suite, d'établir un système de transformation génétique par Agrobacterium tumefaciens à partir d'embryons zygotiques, qui a conduit à des taux de transformation supérieurs à 75%. Les plantes régénérées à partir des cellules transformées sont obtenues en 7 à 8 semaines et des études génétiques et de biologie moléculaire ont confirmé l'état transgénique de ces plantes. L'étude de l'influence de divers paramètres du protocole nous a permis de montrer l'importance d'un prétraitement hormonal des embryons zygotiques avant leur transformation, traitement hormonal qui entrainerait un état de compétence à la transformation génétique des cellules végétales. Nos études ont montré, aussi bien pour les embryons zygotiques que pour les cotylédons, les feuilles ou les racines, que les cellules aptes à la transformation génétique par Agrobacterium tumefaciens étaient de type dédifferencié : cellules de petite taille, isodiamétriques, à noyau proéminent et à fine paroi cellulaire. Les analyses morphologiques de la descendance des plantes transgéniques ont permis de montrer que certaines variations auraient pour origine des altérations transitoires liées à la culture in vitro. D'autres variations semblent provenir de mutations non liées au T-DNA. Seul le phénotype d'une plante pourrait correspondre à une mutation liée à l'insertion du T-DNA. Cette plante présente des aberrations morphologiques avec des feuilles, épaisses et aux bords dentés, des fleurs avec des sépales et des pétales atrophiés ainsi qu'un pistil présentant un enroulement plus ou moins prononcé. A partir du système de transformation établi chez Arabidopsis thaliana, nous avons pu transformer des cellules d'embryons zygotiques chez le colza, la luzerne, le pétunia, la tomate. Ces résultats permettent d'envisager l'application de notre protocole de transformation à d'autres espèces végétales

Titre traduit

Experimental conditions for genetic transformation of zygotic embryos in Arabidopsis thaliana L. (genotype C24) and extension to other plant species

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