Les arn catalytiques comme outil genetique un ribozyme un peu marteau

Catalytic rna as genetic tool

• Auteur / Autrice : Édouard Bertrand
• Direction : Raoul Pictet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1994
• Etablissement(s) : Paris 6

Résumé

Pouvoir inhiber a volonte l'expression d'un gene permet de tres nombreuses applications, tant en recherche fondamentale, par exemple pour une analyse genetique du developpement embryonnaire, qu'en recherche appliquee, par exemple pour la therapie genique. Bien que plusieurs outils soient actuellement disponibles pour bloquer la fonction d'un gene, leur mise en uvre est souvent delicate, et leur succes n'est pas assure. Parmi ces outils, les anti-messagers sont un cas a part. Ils sont d'une part faciles a utiliser et sont potentiellement universels, et, d'autre part, ils presentent l'avantage unique de pouvoir etre controles par un promoteur inductible et/ou tissu-specifique. A l'aide des anti-messagers, il est donc theoriquement possible de controler l'inhibition d'un gene de maniere tres precise, a la fois dans l'espace et dans le temps. Cette propriete des anti-messagers en fait un outil tres attractif pour une etude genetique du developpement puisqu'elle permet, en creant des mutations inductibles, de contourner les problemes poses par la pleiotropie et la redondance des genes regulateurs. Le probleme principal de l'utilisation des anti-messagers classiques, les antisens, vient de l'imprevisibilite de leur efficacite. Les ribozymes sont des outils tres similaires aux antisens, mais leurs sont theoriquement superieurs puisqu'ils sont capables de cliver l'arn auquel ils s'apparient. Les premiers tests in vivo de l'activite des ribozymes ont montre que ces molecules n'etaient pas suffisamment efficaces pour etre utilisees directement comme outil genetique. Mon travail s'est donc attache a comprendre les parametres determinant l'activite des ribozymes, in vitro et en culture de cellules, pour pouvoir ensuite ameliorer leur activite. L'etape limitante de la reaction in vivo a notamment pu etre identifiee (la liaison du ribozyme a son arnm cible), ainsi que quelques facteurs capables d'augmenter la vitesse de cette etape in vitro et/ou in vivo, comme la concentration intracellulaire du ribozyme, sa structure, et l'accessibilite de la sequence cible du substrat. Des vecteurs d'expression du ribozyme, concus specialement pour optimiser ces parametres, ont ete construits et testes. Ces optimisations se sont cependant averees insuffisantes pour faire des ribozymes un outil efficace et versatile. Deux autres facteurs capables d'accelerer la liaison ribozyme-arnm cible ont ete identifies par la suite: certaines proteines virales et cellulaires, ainsi que la co-localisation intracellulaire du ribozyme et de sa cible. Ces deux parametres offrent des perspectives nouvelles et seduisantes pour utiliser les ribozymes comme outil genetique