Purification et caractérisation d'une nouvelle glycosidase : l'alpha-D-mannosidase cytosolique de foie de rat

par Thierry Grard

Thèse de doctorat en Biochimie

Sous la direction de Jean-Claude Michalski.

Soutenue en 1994

à Lille 1 .

mots clés

• Glycosidases

Résumé

L'alpha-d-mannosidase cytosolique de foie de rat possede une specificite de substrat tres etroite. Elle hydrolyse les oligosaccharides de type man9glcnac en un unique compose man5glcnac dont la structure est la suivante: man(alpha1-2)man(alpha1-2)man(alpha1-3)man(alpha1-6)man(beta1-4)glcnac. Nous avons entrepris de purifier et de caracteriser cette activite alpha-d-mannosidasique. L'alpha-d-mannosidase cytosolique a ete enrichie 660 fois apres: (1) precipitation au sulfate d'ammonium; (2) chromatographie sur colonne de concanavaline a sepharose; (3) chromatographie d'affinite sur colonne de cobalt immobilise; (4) chromatographie d'echange d'ions sur colonne de deae trisacryl m; (5) chromatographie de gel filtration sur colonne de sephacryl s 200. La masse moleculaire, determinee a l'issue de cette derniere etape, a ete evaluee a 113 kda. L'alpha-d-mannosidase cytosolique ainsi purifiee degrade l'intermediaire polyprenolique man9glcnac2-p-p-dol en un unique produit man5glcnac2-p-p-dol, dont la structure correspond a l'intermediaire polyprenolique limite situe sur la face cytosolique de la membrane du reticulum endoplasmique. Ce resultat confirme l'intervention possible de l'alpha-d-mannosidase cytosolique dans la regulation de la biosynthese des n-glycosylproteines. De plus, au cours des etapes de purification, nous avons reussi a mettre en evidence une seconde activite alpha-d-mannosidasique dans la fraction soluble. Cette seconde alpha-d-mannosidase cytosolique, non retenue sur colonne de cobalt immobilise, degrade le compose man9glcnac en man7glcnac. Cette enzyme presente une grande similitude avec l'alpha-d-mannosidase soluble du reticulum endoplasmique, qui pourrait posseder la particularite d'etre synthetisee dans ces deux compartiments subcellulaires.

Titre traduit

Purification And Characterization Of A New Glycosidase: The Cytosolic Alpha-D-Mannosidase From Rat Liver

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