Recherche Avancée

Thèse soutenue

Caractérisation structurale et fonctionnelle des ferrédoxines II et V de Rhodobacter capsulatus

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Auteur / Autrice : Jean Armengaud
Direction : Yves Jouanneau
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie
Date : Soutenance en 1994
Etablissement(s) : Grenoble 1

Résumé

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Nous avons caracterise d'un point de vue structural et fonctionnel les ferredoxines fdii et fdv de la bacterie photosynthetique rhodobacter capsulatus. Les proprietes des centres 3fe-4s et 4fe-4s de fdii purifiee de r. Capsulatus, ont ete analysees par rpe, dichroisme circulaire magnetique et rmn. Par voltametrie cyclique, les potentiels redox de fdii ont ete determines (-420 mv et -640m, ph 7,5, vs enh). Fdii a ete produite dans escherichia coli par surexpression de son gene de structure fdxa. Elle a ete synthetisee sous forme apoproteine et purifiee (13 mg par litre de culture). Une petite quantite d'holoferredoxine est produite en proportion constante quel que soit le systeme d'expression employe, suggerant que l'insertion des centres fe-s est une etape limitante de la biosynthese de l'holofdii dans e. Coli. L'insertion in vitro de centres fe-s dans l'apoferredoxine conduit a une proteine instable contenant 2 centres 4fe-4s. Des mutants structuraux de fdii ont ete crees par mutagenese dirigee, et exprimes dans e. Coli. L'extremite c-terminale de la proteine intervient dans la stabilite de l'holoproteine. Le residu t71 n'a pas d'influence sur les proprietes redox. Un protocole de mutagenese dirigee par pcr a ete ameliore en incluant dans l'amorce mutagene un site de restriction de classe iis. L'attenuation in vivo de la production de fdii a l'aide d'arns antisens indique qu'elle joue un role essentiel dans le metabolisme de r. Capsulatus. L'expression dans e. Coli du gene fdxd codant pour fdv, conduit a la production de 2,8 mg d'holoproteine par litre de culture. Fdv contient un centre 2fe-2s dont le signal rpe est typique des centres 2fe-2s de ferredoxines de plante. Le potentiel d'oxydoreduction de fdv est de -220 mv (ph 7,5 ; vs enh), valeur proche du potentiel des ferredoxines de type adrenodoxine. Fdv est codee par un gene de type nif indiquant qu'elle joue un role dans la fixation de l'azote moleculaire. In vitro, cette proteine ne sert pas de donneur d'electrons a la nitrogenase. Cette ferredoxine 2fe-2s est donc atypique tant au niveau de ses proprietes que de sa fonction