La mutagenèse par insertion d'ADN chez Chlamydomonas reinhardtii : une nouvelle voie pour l'élucidation de la biosynthèse

par Fabienne Bellanger

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de S. BallL.

Soutenue en 1994

à Compiègne .

mots clés

• Chlamydomonas reinhardtii
• Ns
• Transformation génétique
• Amidon
• Métabolisme
• Biosynthèse
• Mutation
• Polyoside
• Nk

Résumé

Une souche sans paroi de l'algue verte unicellulaire chlamydomonas reinhardtii auxotrophe pour l'arginine a été transformée par le plasmide parg 7. 8 par agitation en présence de billes de verre. Les cellules ayant intégré une copie fonctionnelle du plasmide ont été sélectionnées par leur capacité à croître sur un milieu dépourvu d'arginine, le plasmide portant le gène de l'argino-succinate lyase sauvage complémentant l'auxotrophie. Des souches déficientes pour la biosynthèse de l'amidon ont été sélectionnées parmi les transformants. Parmi les 16 souches présentant un phénotype mutant pour la synthèse d'amidon, 10 accumulent de très faibles quantités du polysaccharide (inferieure à 5% de la quantité mesurée chez la souche sauvage). Deux souches sont mutées pour la synthèse de l'amylose et 4 autres accumulent une amylopectine modifiée. Une analyse génétique de la souche BAF R1 a permis de mettre en évidence l'intégration d'un plasmide parg 7. 8 fonctionnel au locus ST-2, conduisant à la délétion du gène de structure de la GBSS (Granule Bound Starch Synthase). Ceci nous a permis de prouver que la synthèse de longs glucanes n'est pas un prérequis pour la synthèse de l'amylopectine. L'un des mutants pauvres en amidon ne présente pas d'activité ADP-GLC pyrophosphorylase détectable. Cette délétion complémente la mutation ST-1-1 précédemment caractérisée comme défectueuse pour la même activité enzymatique. Ceci suggère que la transformation a conduit à la mutation du deuxième gène de structure de l'ADP-GLC pyrophosphorylase. La présence d'un polysaccharide soluble fortement branché, de type phytoglycogène, a été détectée chez un autre des mutants pauvres en amidon. 50 souches ont également été sélectionnées suite à un maintien de l'amidon dans des conditions qui induisent sa dégradation chez le sauvage.

Titre traduit

Transformation mediated gene disruption in Chlamydomonas reinhardtii : a new tool to investigate starch metabolism

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