Purification et caractérisation de la N-acycleptide hydrolase intestinale de porc

par Véronique Raphel

Thèse de doctorat en Biochimie. Nutrition, aspects moléculaires et cellulaires

Sous la direction de Antoine Puigserver.

Soutenue en 1994

à Aix-Marseille 3 .

mots clés

• Acétylation
• Protéines -- Purification
• Hydrolases

Résumé

En 1978, il a ete montre au laboratoire que des rats en croissance sont capables d'utiliser efficacement pour leur synthese proteique de la caseine dont tous les residus de lysine sont acetyles par de la n-acetyl-l-methionine. Une activite de type acetylamino-peptidasique est responsable au niveau intestinal de l'hydrolyse de la liaison isopeptidique. Il nous a semble important de caracteriser cette enzyme afin de preciser sa fonction dans la digestion des substrats proteiques alimentaires ou le catabolisme des proteines cellulaires. Nous avons purifie jusqu'a l'homogeneite une acylpeptide hydrolase a partir de muqueuse intestinale de porcs adultes en combinant des precipitations par le sulfate d'ammonium et des chromatographies d'echange d'ions, d'affinite et de filtration. L'enzyme est un tetramere de 280 kda constitue de sous-unites apparemment identiques de 762,4 kda. Son extremite n-terminale est bloquee, probablement par acetylation, et sa composition en acides amines est comparable a celle trouvee pour l'enzyme hepathique de porc et de rat. Son extremite c-terminale est une serine et son ph optimum d'action est voisin de 8. Les parametres cinetiques de l'hydrolyse de petits peptides de type n-acetyl-(l-alanine)#n avec n=2 a 4 catalysee par l'enzyme, montrent que la vitesse maximale de liberation de la n-acetyl-l-alanine diminue lorsque la longueur de la chaine augmente, le km etant de 0,70,1 mm. L'alanine n-acetylee est un inhibiteur competitif de l'enzyme lors de l'hydrolyse de son substrat synthetique, le n-acetyl-l-alanine-p-nitroanilide. Avec le d-stereoisomere, l'inhibition serait de type mixte, avec une forte composante incompetitive. L'etude du site actif de l'acylpeptide hydrolase intestinale de porc realisee par marquage au dfp et par l'action d'inhibiteurs montre que cette enzyme appartient a la classe des proteases a serine comme c'est le cas de plusieurs endopeptidases digestives, alors qu'ici il s'agit d'une exopeptidase. A l'aide d'anticorps polyclonaux diriges contre l'enzyme intestinale de porc, il a ete possible de montrer que cette proteine, ou son homologue structural, est vraisemblablement presente dans d'autres tissus chez le porc et le rat. Dans cette derniere espece la distribution de l'activite enzymatique ne varie pas le long de l'axe crypte-villosite au niveau intestinal. Outre son intervention dans les etapes ultimes de la digestion des proteines alimentaires naturellement ou artificiellement n-acetylees, l'acylpeptide hydrolase est probablement impliquee dans le catabolisme des proteines intracellulaires dont on sait qu'une fraction tres importante est n-acetylee

Titre traduit

Purification and characterization of the porcine intestinal n-acylpeptide hydrolase

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