Affinement de la structure de la collagenase d'hypoderma lineatum a 1,8 a de resolution

Refinement of the hypoderma lineatum collagenase structure at 1. 8 a resolution

• Auteur / Autrice : Isabelle Broutin
• Direction : Arnaud Ducruix
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1993
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

Les collagenases, seuls enzymes degradant le collagene dans les conditions physiologiques de ph et de temperature, jouent un role essentiel pour l'equilibre dynamique du collagene dans le tissu conjonctif. Elles appartiennent a deux familles, les metallo-proteases et les proteases a serine. La collagenase que nous avons etudiee appartient a cette derniere. Elle est extraite des parasites du betail hypoderma lineatum, responsables de l'hypodermose qui affecte certains mammiferes et provoque une baisse des rendements zootechniques. La collagenase d'hypoderma lineatum a un poids moleculaire de 25200 daltons pour 230 acides amines. Elle cristallise dans le groupe d'espace i422, en presence de sulfate d'ammonium a ph neutre, en absence d'inhibiteur. Les parametres de maille sont a=111,7 a et c=165,8 a avec deux molecules par unite asymetrique. Elle est inhibee par le dipf mais aucun inhibiteur peptidique n'est connu a ce jour. Au debut de cette these ont ete commercialises des detecteurs bidimensionnels. Nous avons utilise la collagenase comme outil de calibration pour tester le fast (enraf nonius), le xentronics (siemens), et enfin, lorsqu'il fut disponible, le prototype mark ii (detecteur realise a lure par r. Kahn et col. En collaboration avec le groupe de g. Charpak au cern). Nous avons effectue une etude comparative qui montre que la qualite des jeux de donnees obtenus a l'aide de detecteurs commerciaux et de sources conventionnelles s'est nettement amelioree durant ces dernieres annees tout comme les programmes de traitement du signal. Pour obtenir des donnees a haute resolution, l'utilisation conjointe du rayonnement synchrotron et du detecteur prototype mark ii reste la reference. La resolution de la structure de la collagenase a ete initiee lors de la these de doctorat de b. Arnoux (1985) mais n'avait pu etre menee a bien. La position des deux molecules de l'unite asymetrique avait ete determinee a 3 a de resolution, mais la structure necessitait une reconstruction importante au niveau des boucles. Nous avons du utiliser des methodes nouvelles et classiques pour amorcer la convergence de l'affinement. Plusieurs reconstructions manuelles sur ecran graphique furent ensuite necessaires avant de pouvoir reinterpreter la carte de densite electronique. Le facteur d'accord r final est de 18,3% sur la totalite des reflexions a 1,8 a de resolution et 295 molecules d'eau ont ete placees dans la densite electronique. Les nombreuses difficultes pour resoudre cette structure ont ete interpretees a posteriori par la mauvaise qualite des phases mir (76) et un modele de depart errone (rms=3 a) qui ont bloque pendant longtemps le processus d'affinement. La courbe de luzzati montre que l'erreur sur les positions atomiques de la structure finale est comprise entre 0,15 et 0,25 a. La collagenase d'hypoderma lineatum est constituee de deux domaines de feuillets anti-paralleles replies en tonneau. Elle possede trois ponts disulfure qui stabilisent la structure. Les deux molecules de l'unite asymetrique sont reliees entre elles par un pseudo axe de symetrie non cristallographique d'ordre 2. L'ecart moyen sur la chaine principale est de 0,27 a. La collagenase presente la meme structure secondaire que les autres proteases a serine. Elle coupe des substrats de la thrombine et de la kallikreine, bien que l'encombrement de sa poche specifique soit similaire a celle de l'elastase (val-216, val-226, ser-189). La collagenase ayant ete clonee recemment, rendant possible une etude structure/fonction pour determiner sa specificite vis-a-vis du collagene