Clonage et expression chez Escherichia coli de gènes de bacteroides thetaiotaomicron impliqués dans la dégradation des pectines

par Yann Tierny

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Jean-Baptiste Guillaume.

Soutenue en 1992

à Lille 1 .

mots clés

• Bactéroïdes
• Pectine

Résumé

Bacteroides thetaiotaomicron est une bactérie à gram-négatif, anaérobie stricte, vivant dans le tractus gastro-intestinal de l'homme et capable de dégrader plusieurs polysaccharides végétaux tels que les dextrans et pectines. Afin de mieux connaître la structure et la régulation des gènes impliqués dans la dégradation des pectines, nous avons réalisé une banque d'ADN génomique de la souche B. Thetaiotaomicron 217 dans le vecteur phagique lambda EMBL3. Un clone pectinase-positif a été mis en évidence sur gel de polygalacturonate de magnésium par formation d'une dépression autour de la plage de lyse sur 2000 plages observées. Le bactériophage pectinolytique a été purifié, amplifié et le stock obtenu a servi à infecter une culture d'Escherichia coli LE392. Les tests d'activité effectués au niveau du surnageant de lyse ont permis de révéler la présence des activités pectine méthylestérase et pectate lyase. Une carte de restriction détaillée de l'insert de 13,2 kb a été établie, ce qui a permis, par sous-clonage des fragments Sa11 dans les vecteurs pDR720 et pBR322, et des fragments EcoR1 dans le pBR325, de préciser l'emplacement des gènes pme et pel et de les isoler afin d'étudier leur expression chez E. Coli. Les activités clonées ont été localisées et les caractéristiques biochimiques de la pectate lyase ont été étudiées. Le séquençage ultérieur des gènes pme et pel devrait permettre de préciser leur structure et mode de régulation. Le transfert et l'expression hétérologue de ces gènes chez d'autres espèces de bacteroides et chez des souches sécrétrices de Bacillus devrait conduire à des niveaux d'activités supérieurs, et extracellulaires

Titre traduit

Molecular cloning and expression in Escherichia coli of genes from bacteroides thetaiotaomicron involved in pectin degradation

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