Production et sécrétion du système hydrolytique de Sclerotinia sclerotiorum : analyses biochimiques et génétiques

par Christine Riou

Thèse de doctorat en Sciences

Sous la direction de Michel Fèvre.

Soutenue en 1991

à Lyon 1 .

mots clés

• Champignons phytopathogènes
• Étiologie
• Protoplastes végétaux
• Pectinases

Résumé

Les champignons phytopathogenes produisent des complexes enzymatiques capables d'hydrolyser les polymeres pectiques, hemicellulosiques et cellulosiques, constituants des parois cellulaires vegetales. Afin d'etudier les aspects biochimiques et moleculaires de la photopathogenese, notre travail a porte sur le systeme hydrolytique secrete par le champignon phytopathogene, sclerotinia sclerotiorum. La mutagenese induite de protoplastes a permis d'isoler des souches alterees dans la production de glucanases et/ou de -glucosidases. Des tests de pathogenicite, realises in situ sur des plantules de tournesol et des feuilles de haricot, ont mis en evidence une bonne correlation entre les activites glucanasiques et le pouvoir pathogene des mutants. La caracterisation de l'equipement enzymatique secrete par s. Sclerotiorum et l'utilisation de substrats inducteurs et represseurs ont permis de definir les conditions de secretion de 13 enzymes lytiques (7 exo- et 6 endo-enzymes). Les enzymes pectinolytiques sont produits de facon constitutive, mais leurs activites augmentent dans les cultures effectuees sur les substrats complexes. La secretion des enzymes cellulolytiques est induite par les polysaccharides et reprimee par les sucres simples (glucose et xylose). Les inducteurs apparaissent aspecifiques, car les substrats pectiques et cellulosiques induisent simultanement les deux types d'activites enzymatiques. L'analyse en chromatographie de filtration a montre l'apparition de nouvelles formes moleculaires de certains enzymes, en fonction du milieu inducteur. Les isoelectrofocalisations preparatives et analytiques ont permis de mettre en evidence la complexite des systemes enzymatiques, l'existence de nombreux isoenzymes pour chaque activite et de reveler l'aspecificite de certaines activites. Trois enzymes ont ete purifies: une -galactosidase, une exo-polygalacturonase et une exo-polymethylgalacturonase. Ils ont ete caracterises pour leurs proprietes physicochimiques (pm, p, ionisation, optimum de ph, optimum de temperature, stabilite a la temperature et influence des ions), leurs modes d'action et leurs specificites. Leurs sequences n-terminales ont ete determinees. Des anticorps polyclonaux diriges contre les trois proteines purifiees ont ete produits et utilises pour etudier la secretion des enzymes par western blotting. L'extraction et la purification d'arn poly (a)#+ ont ete realisees. La traduction in vitro des arnm a permis de mettre en evidence l'expression specifique de genes au cours de l'induction des enzymes. Les anticorps specifiques des enzymes et les sondes d'oligonucleotides correspondant aux sequences n-terminales des proteines purifiees permettent d'envisager l'isolement des genes a partir d'une banque genomique construite dans le vecteur embl3 et de banques d'adnc construites dans le vecteur zap

Titre traduit

Production and secretion of the hydrolytic system of sclerotinia sclerotiorum: biochemical and genetical analysis

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