Marquage carboxyl-terminal de protéines : deux approches complémentaires utilisant la transpeptidation catalysée par la carboxypeptidase y

par Pierre-François Berne

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Jean-Marie Schmitter.

Soutenue en 1991

à Palaiseau, Ecole polytechnique .

Le président du jury était Sylvain Blanquet.

Le jury était composé de Pierre Fromageot, Jean-François Mayaux.

Les rapporteurs étaient Jeannine Yon-Kahn, Bruno Ribadeau-Dumas.

mots clés

• Protéines -- Marquage par affinité
• Protéines

Résumé

En dépit de nombreuses tentatives, aucune méthode de caractérisation non ambigue de l'extrémité c-terminale des protéines ne s'est encore imposée. Une solution pourrait être fournie par le marquage radioactif spécifique des protéines a cette extrémité, les applications possibles d'un tel outil sont de deux sortes: détermination de la structure primaire des polypeptides et obtention d'informations conformationnelles. Nous avons développé deux approches distinctes du marquage c-terminal répondant séparément a ces deux problèmes et reposant, toutes deux, sur la transpeptidation catalysée par la carboxypeptidase y. Cette réaction consiste en la substitution de la liaison normalement hydrolysée par la carboxypeptidase y par une nouvelle liaison, mettant en jeu un nucléophile exogène. Dans le cadre d'une première approche, nous avons étudié la transpeptidation de substrats peptidiques modèles a ph neutre en présence d'une variété de nucléophiles. Cette étude a révelé que l'obtention de rendements de transpeptidation satisfaisants était subordonnée a la présence d'un résidu proline en position penultieme ou antepenultieme du peptide substrat. Pour de tels peptides, il a été montré que la transpeptidation se produit spécifiquement du cote c-terminal de la proline, ce qui suggère un rôle déterminant de ce résidu pour la transpeptidation. Nous avons ensuite transpose ces résultats a une protéine. Pour cela nous avons utilisé un variant de la methionyl-arnt synthetase d'escherichia coli obtenu par mutagenese dirigée, avec la séquence c-terminale glu-pro-met. Nous avons pu marquer spécifiquement le variant a son extrémité c-terminale avec de la methionine tritiee alors que la forme non modifiée de la methionyl-arnt synthetase n'est pas un substrat convenable. La seconde approche repose sur l'estérification par voie chimique du substrat, suivie d'une transpeptidation catalysée par la cpy a ph b

Titre traduit

Carboxyl-terminal labeling of proteins: two complementary approaches using carboxypeptidase y-catalyzed transpeptidation

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