La chromatographie de pseudo-bio-affinité : Utilisation d'un ligand général "Histidine" pour la purification et la dépyrogénation du facteur anti-hémophilique A du plasma humain

par Mohamad Ezzeddine

Thèse de doctorat en Génie enzymatique, bioconversion et microbiologie

Sous la direction de Mookambeswaran A. Vijayalakshmi.

Soutenue en 1990

à Compiègne .

mots clés

• Dépyrogénation
• Cryoprécipité
• Hémostase
• Chromatographie d'affinité
• Histidine
• Produits chimiques -- Purification
• Endotoxines
• Pyrolyse
• Microbiologie pharmaceutique
• Plasma sanguin

Résumé

Le présent travail comprend une étude de la séparation et la dépyrogénation du facteur anti-hémophilique A du plasma humain, en utilisant un ligand général l'acide aminé "histidine". Dans la première partie, nous avons étudié la structure du FVIII et son rôle dans l'hémostase primaire. Dans la deuxième partie, une étude bibliographique concernant la chromatographie de bio-affinité et de pseudo-bio-affinité est décrite. Nous avons signalé l'importance des ligands biologiques tels que l'histidine, utilisé comme ligand général pour la purification d'une large gamme de protéines. Dans la partie "Résultats", nous avons montré la possibilité de purification du FVIII sur l'histidine et nous avons optimisé les conditions opératoires pour assurer une meilleure résolution. La matière première joue un rôle important dans la pureté du produit final et nous avons mis au point un procédé d'obtention de FVIII d'ultra haute pureté (UHP) en deux étapes chromatographiques. Nous avons montré l'importance du Sepharose comme matrice pour minimiser les interactions non-spécifiques. Les pyrogènes constituent un problème majeur pour les industries pharmaceutiques nous avons élaboré une technique d'élimination des endotoxines d'abord d'après une étude du comportement des endotoxines sur le support couplé à l'histidine et l'application de cette technique pour la dépyrogénation du FVIII. Les résultats ainsi obtenus méritent une exploitation industrielle du procédé même pour la dépyrogénation d'autres protéines plasmatiques. Sur le plan fondamental, nous avons réalisé une série d'expériences qui ont montré la présence d'interactions du type ionique, transfert de charge et hydrophobe entre l'histidine et le FVIII. Nous avons montré aussi la présence des sites de reconnaissances par l'histidine immobilisé sur les deux molécules du complexe. Un de ces sites de reconnaissances est localisé sur la chaine légère de la molécule FVIII:C. Nous avons étudié quantitativement l'interaction Histidine-FVIII, l'histidine immobilisé a montré une meilleure affinité à l'égard du FVIII que l'histidine libre montrant ainsi l'orientation spatiale de la molécule d'intérêt.

Titre traduit

Pseudo-bio-affinity chromatography : Utilization of a general ligand "Histidine" for the purification and the depyrogenation of anti-hemophilic factor A of human plasma

Résumé

The present work deals with the separation and the depyrogenation of the anti-hemophilic factor A of the human plasma using the amino acid Histidine as a general ligand. Ln the first part, we have studied the structure of the factor VIII and its role in the primary hemostasis. Ln the second part, a literature survey was carried in the area of bio-affinity chromatography and pseudo-bio-affinity chromatography. We have shown the importance of biological ligands like histidine for the purification of a wide range of proteins. Ln the "results", we have shown the possibility of the purification of factor VIII with histidine and optimized the operating conditions for a better resolution. The starting material plays an important role in the purity of the final product. We have established a method to obtain an ultra pure factor VIII by using two chromatographical steps. We have shown the importance of Sepharose as a matrix to minimize the non-specific interactions. We have developed a technique to eliminate endotoxin in pharmaceutical products, first we studied the behaviour of endotoxin over the matrix coupled with histidine and the application of this technique for the depyrogenation of FVIII. The results thus obtained merits an industrial exploitation even for the depyrogenation of other plasma proteins. We have tried to understand the fondamental aspects of this interaction and we have carried out a series of experiments to show the type of interaction like ionic, charge transfert and hydrophobic between histidine and factor VIII. We have also shown the presence of the recognition sites of histidine with the two molecules of the complex. One of this recongnition sites is located over the light chain of factor VIII:C molecule. Our quantitative study of the Histidine-FVIII interaction showed thaï the immobilised histidine has more affinity towards FVIII than the free histidine. Thus showing the spatial orientation of the molecule of interest.