Préparation et caractéristiques d'une γ-D-glutamyl-(l)meso-diaminopimélate endopeptidase (endopeptidase I) de bacillus sphaericus

par Fatima Baji

Thèse de doctorat en Sciences. Biochimie

Sous la direction de Micheline Guinand.

Soutenue en 1989

à Lyon 1 .

Le jury était composé de Micheline Guinand.

mots clés

• Bactéries Gram positives
• Bactéries aérobies
• Endopeptidases
• Métalloenzymes
• Bacilles
• Peptidoglycanes

Résumé

L'endopeptidase I hydrolyse la liaison γ-d-glutamyl-meso-diaminopimelate des substrats derivés du peptidoglycane : X-L-Ala-γ-D-Glu-(L)ms-A2pm(L)-D-Ala. Le procédé de purification et une caractérisation partielle de la protéine ont été publiés. Le rendement à partir du milieu de sporulation était faible (7,5 [mu]g/l). Nous l'avons amélioré en utilisant une culture industrielle de 1100 l de B. Sphaericus et en mettant au point une méthode de désorption de l'enzyme à partir des pores qui sont broyées en présence de billes de verre et traitées successivement par le lysozyme et NaCl 2M. La purification a été menée en parallèle avec les deux sources d'enzymes : milieu de sporulation et spores. On a obtenu 3,4 et 10,3 mg d'enzyme. La similitude des caractéristiques : Mr 45000, π 5,4 Km 0,57 et 0,8 mM, Vm 8,3 et 14,3 [mu]moles. Min-1. Mg-1, démontre leur identité. Il reste une quantité importante d'endopeptidase i dans les spores, après la désorption exposée ci-dessus. Les détergents anioniques, cationiques, diioniques, ou non ioniques sont des activateurs de l'enzyme. Aucun d'entre eux cependant ne conduit a une désorption complémentaire de l'enzyme. L'endopeptidase i est une métalloenzyme, l'étude de l'émission de rayons x induite par un faisceau de protons, montre qu'elle possède 2 ions Zn²+ par molécule. L'un d'eux est cofacteur de l'enzyme. Le potassium a raison de 10 atomes par atome de zinc est également présent. Une séquence N-terminale de 23 amino-acides et 3 sequences internes de 21, 18 et 12 amino-acides ont été déterminées après protéolyse par la papaine. Ces séquences devraient permettre d'aborder des expériences de génie génétique

Titre traduit

Preparation and characterization of the gamma-d-glutamyl-(l)meso-diaminopimelate endopeptidase i from bacillus sphaericus

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