Contribution à l'étude de l'échange d'hydrogène associé aux carboxylations dépendant de la vitamine K

par Anne Righini-Tapié

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Directeur de thèse inconnu.

Soutenue en 1985

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .

mots clés

• Synthèse enzymatique
• Molécules marquées
• Mécanisme enzymatique
• Carboxylation
• Stéréochimie
• Vitamines K

Résumé

Cette thèse présente une étude de l’échange d’hydrogène lié aux carboxylations dépendant de la vitamine K. Les acides glutamiques, stéréospécifiquement marqués au tritium en 4 ont été préparés : l’un d’eux a été obtenu chimiquement par réduction du bromure correspondant par le borohydrure tritié ; dans l’autre, le tritium a été introduit par une voie enzymatique. Les acides 4-méthyl L-glutamiques ont été obtenus par une amination réductive de l’acide 2-céto 4-méthul glutarique catalysée par la glutamate déshydrogénase. En vue de l’introduction dans des peptides de ces acides, une nouvelle méthode de protection des acides glutamiques et de leurs analogues, basée sur l’activité enzymatique de la chymotrypsine, a été mise au point. Les peptides ainsi obtenus ont permis de déterminer la stéréochimie de l’échange de tritium associé à la carboxylation dépendant de la vitamine K, et d’étudier un inhibiteur de la carboxylation vis-à-vis de l’échange. Les résultats obtenus permettent d’attester que l’échange observé fait bien partie du mécanisme de la carboxylation.

Titre traduit

Studies about the hydrogen exchange associated with vitamin K-dependant carboxylation

Résumé

L-glutamic acids stereospecifically labelled at L-4 with tritium have been synthetized: (2S, 4R) – [4-³H] acid was obtained by reduction by ³[H] sodium borohydride of the corresponding 4-bromo-glutamic acid, while the (2S, 4S)-[4-³H] glutamic acide was obtained by an enzymatic pathway. The (2S, 4R) and (2S, 4S) 4-methyl glutamic acids have been prepared by glutamate deshydrogenase catalyzed, reductive amination of 2-keto (4RS) 4-methyl glutaric acid. We then studied the chymotrypsine catalyzed hydrolysis of L-dibenzyl N-t-butyloxycarbonyl glutamate, in order to obtain a partially deprotected compound, directly suitable for peptide synthesis. The use of substrate peptides containing stereospecifically 4-tritiated glutamic acid allowed us to demonstrate, in the absence of carboxylation, a stereoselective hydrogen exchange affecting the same 4-pro S hydrogen abstracted in the carboxylation reaction. A 4-methyl (“threo”) L-glutamic acid containing peptide exerts the same competitive inhibition on the exchange and on the carboxylation reactions. These results assure that the previously demonstrated hydrogen exchange is part of the mechanism of the carboxylation reaction.