Rôle du facteur tissulaire dans les complications thromboembolliques des leucémies aigues lymphoblastques de l'enfant

par Claire Pluchart

Projet de thèse en Sciences - STS

Sous la direction de Philippe Nguyen.

Thèses en préparation à Reims , dans le cadre de Ecole doctorale Sciences, technologies, santé (Reims, Marne) , en partenariat avec (HERVI) Hémostase Et Remodelage Vasculaire post-Ischémie (laboratoire) depuis le 15-01-2013 .


  • Résumé

    Sujet Activité du facteur tissulaire et rôle dans les complications thrombotiques au cours du traitement des leucémies aigues lymphoblastiques chez l'enfant. Situation dans le contexte scientifique et médicale et Intérêt du travail Cancer, leucémie aigue lymphoblastique et complications thrombo-emboliques La leucémie aigue lymphoblastique est la pathologie maligne la plus fréquente chez l'enfant . Les progrès dans le traitement ont permis d'obtenir, grâce aux protocoles de chimiothérapie intensive, des taux de guérison atteignant 85%. Cependant, ces traitements sont associés à une morbidité et à un risque, très faible, de décès toxique. La prévention de ces complications est donc devenue un objectif majeur dans les essais cliniques . Les liens entre complications thrombo-emboliques et cancer sont étudiés depuis des décennies. Ce phénomène intéresse également les leucémies aigues myéloïde ou lymphoïdes. Concernant les leucémies aigues lymphoblastiques de l'enfant, ce sont parmi les complications les plus fréquentes et les plus graves au cours du traitement. Selon les études la fréquence est estimée entre 1 et 36,7%. Dans une méta-analyse comprenant 1752 patients, le taux de thrombose était de 5,2% alors que l'on estime l'incidence des thromboses veineuses dans la population pédiatrique générale à 1 pour 100000 enfants. L'impact est majeur : la moitié de ces phénomènes atteint le système nerveux central, la mortalité est d'environ 15% et la survenue de cet évènement compromet ou retarde la poursuite du traitement optimal. Etude de l'hémostase dans les leucémies aigues lymphoblastiques La pathogénie de ce risque accru de thrombose n'est pas complètement élucidée mais résulte de l'association de plusieurs facteurs qui vont favoriser le déséquilibre entre agents pro- et anticoagulant. Ce déséquilibre a été mis en évidence au moment du diagnostic et va se majorer pendant les premiers mois de traitement, entraînant une augmentation de la génération de thrombine. L'interaction des cellules malignes avec d'autres types cellulaires comme les cellules endothéliales pourraient participer à l'activation de la coagulation. Le rôle de certaines chimiothérapies a également été étudié : l'excès de thrombine induit par la suppression des anticoagulants naturels lors du traitement par asparaginase et à une moindre échelle les corticoïdes sont probablement le facteur principal du risque thrombo-embolique. Certaines chimiothérapies comme la vincristine peuvent par ailleurs entrainer des lésions de l'endothélium vasculaire. Enfin l'association éventuelle à une thrombophilie augmente ce risque par son interaction avec les facteurs de risque précedemment cités. Facteur Tissulaire et Leucémie aigue lymphoblastique Le Facteur tissulaire est une glycoprotéine transmembranaire exprimée par les fibroblastes de la paroi vasculaire et les cellules épithéliales. Son expression est également inductible dans d'autres types cellulaires comme les cellules endothéliales, les monocytes ou les cellules musculaires lisses. Des transcrits alternatifs ont récemment été mis en évidence : l'asTF, composant soluble et circulant et le FT-A présent principalement dans des lignées tumorales. Le facteur tissulaire joue un rôle central dans la coagulation comme cofacteur du facteur VIIa dans l'activation des facteurs X et IX classiquement lors d'une lésion de l'endothélium permettant au facteur tissulaire d'être au contact des autres acteurs de la coagulation. Cette vision est remise en question avec la mise en évidence de facteur tissulaire intravasculaire dont l'origine est discutée (soluble et/ou à la surface des plaquettes, des leucocytes ou des microvésicules) de même que son rôle dans la coagulation. Le facteur tissulaire a également un rôle dans la régulation de différentes voies de signalisation inhibant l'apoptose ou activant l'angiogenèse. Le facteur tissulaire est de ce fait surexprimé dans de nombreux cancers. Concernant les leucémies aigues, l'expression et l'activation du FT ont été mis en évidence au niveau des blastes de patients atteints de leucémie aigue promyélocytaire (29) mais également d'autres types de leucémies aigues myéloïdes ou lymphoblastiques. Ces études supportent l'hypothèse d'un état procoagulant de la surface des blastes pouvant contribuer aux complications thrombotiques. L'équipe de P Schneider a étudié les modifications de différents acteurs de la coagulation chez 36 enfants traités pour une leucémie aigue lymphoblastique selon le protocole FRALLE 2000. Les résultats suggèrent que le facteur tissulaire participe à la génération de thrombine dans cette pathologie. Ils soutiennent l'hypothèse d'une activation du facteur tissulaire majoritairement liée à des lésions endothéliales secondaires à la lyse des blastes et au traitement. Ces lésions seraient à l'origine de l'expression du facteur tissulaire. Microparticules et leucémie aigue lymphoblastique Des niveaux importants de microparticules membranaires dans la circulation ont été mis en évidence dans la littérature dans des pathologies associées à un risque thrombotique élevé, en particulier dans les pathologies cancéreuses. Ces microparticules ont plusieurs origines et peuvent avoir par l'expression de phospholipides à leur surface une action pro-coagulante. Dans les leucémies aigues lymphoblastiques, ces microparticules peuvent avoir des origines différentes. Après induction de l'apoptose de cellules d'une ligné de leucémie aigue lymphoblastique pré-B utilisée comme lignée contrôle, Casciola-Rosen met en évidence l'expression accrue de phosphatidyl-sérine (reflet de la formation de microvésicules) et un effet procoagulant via cette expression. P. Schneider étudie également le rôle des microparticules dans la leucémie aigue lymphoblastique de l'enfant. Du fait de leur persistance à un stade avancé du traitement (concomitant de la disparition des blastes) leur origine pourrait également être les cellules endothéliales lésées par la chimiothérapie. La présence de facteur tissulaire à la surface de ces microparticules a été étudiée et correspond à une fraction du facteur tissulaire dit intravasculaire. Le rôle dans l'initiation de la coagulation de cette fraction du facteur tissulaire a été étudié : Wang montre que l'apoptose via la modification d'expression des phospholipides permet l'activation du facteur tissulaire, selon Muller il jouerait un rôle important via l'interaction des microvésicules et des plaquettes et Gross met en évidence sa présence dans les thrombi générés in vivo. Dans différentes lignées issues de tumeurs solides la source majeure de facteur tissulaire semble être ces microparticules. L'intérêt d'évaluer le risque thrombotique au diagnostic et la prévention des complications thrombo-emboliques reste discuté. Une meilleure compréhension de la pathogénie de ces complications et du rôle du facteur tissulaire permettrait d'aider à définir des groupes à risques et de discuter l'efficacité et l'innocuité d'une anticoagulation prophylactique ou d'une thérapie substitutive. En conclusion, cette étude pourrait permettre de comprendre les mécanismes sous-tendant les complications thrombo-emboliques dans les leucémies aigues lymphoblastiques et ainsi de les prévenir et les traiter plus efficacement. Méthodes utilisées Pour approfondir l'analyse du rôle du facteur tissulaire dans les complications thrombo-emboliques nous étudierons d'abord l'expression du facteur tissulaire et de ses variants par les lymphoblastes par PCR quantitative, Western Blot et cytométrie de flux, - dans des lignées de leucémies aigues lymphoblastiques (et myéloblastique) - sur des échantillons de patients atteints de leucémies aigues lymphoblastiques : au diagnostic et aux différentes phases du traitement. L'étude des microparticules présentes dans les leucémies aigues lymphoblastiques permettra d'identifier leur origine (lymphoblaste, cellules endothéliales) et de les caractériser en terme d'expression du facteur tissulaire. Ensuite, afin d'étudier l'activité du facteur tissulaire, nous mesurerons par des études fonctionnelles la capacité des lymphoblastes et les microparticules à entrainer la formation de facteur X activé et de thrombine. Cette étude permettra d'analyser les liens entre l'activité pro-coagulante des blastes et des microparticules et l'activité de l'anti-thrombine. Le mode de prévention optimale pourra alors être discuté : traitement de substitution de l'anti-thrombine ou utilisation de nouveaux anticoagulants dont l'action n'est pas liée à celle-ci.

  • Titre traduit

    Tissue Factor activity during treatment of children with acute lymphoblastic leukemia and its role in thrombotic complications.


  • Résumé

    Acute lymphoblastique leukaemia is the most common type of cancer diagnosed in children . Advanced in its treatment have resulted in cure rates of nearly 85% with modern intensive chemotherapy. However, intensive treatment imposes morbidity and for a small minority, mortality. The reduction of those complications has become an increasing focus of clinical trials . Thromboembolic events are among the more frequent and serious complications of acute lymphoblastic leukaemia and its treatment and represent a potentially reversible cause of morbidity and mortality. In a meta-analysis comprising 1752 paediatric patients, the rate of thrombosis was 5.2% whereas the estimated annual incidence of venous thrombosis in the paediatric population is about 1 per 100000 children. Half of thrombotic events occur in the central nervous system. The pathogenesis of this increased thrombotic risk is not fully understood, but includes a combination of variables related to the disease itself, its treatment, and the host. At diagnosis and during first several months of therapy, there is evidence of increased thrombin generation. Although the exact etiology of thrombin generation is not known, it is likely to be secondary to a very complex interaction of malignant cells with other cellular elements like endothelial cells leading to activation of coagulation. The importance of treatment in the pathogenesis of acute lymphoblastic leukaemia is highlighted by the observation that thrombosis rarely occurs at diagnosis. Asparaginase and steroids are the most extensively studied drugs. Ineffective regulation of excess thrombin induced by suppression of natural anticoagulants secondary to asparaginase therapy is thought to be a major contributing factor. Inherited thrombophilia increases the thrombotic risk in acute lymphoblastic leukaemia patients. However, the interest of a screening of thrombotic risk at diagnosis and of the prevention of this complication remains unclear. A better comprehension of the pathogenesis of thrombotic events would help to define high-risk groups and to discuss safety and efficacy of anti-coagulant prophylaxis or replacement therapy. P Schneider and al. studied haemostatic modifications induced by the French Acute Lymphoblastic Leukemia group (FRALLE)-2000 protocol in 36 children. In addition to the classical factors (coagulation factors, physiological inhibitors), the balance between procoagulant and anti-coagulant activity was analysed using tissue factor activity, thrombomodulin activity and procoagulant phospholipid-dependant assays. Markers of endothelium injury like thrombomodulin antigen, von Willebrand factor antigen and free tissue factor pathway inhibitor were also investigated. The results suggest the implication of tissue factor in thrombin generation and support the hypothesis of endothelial injury induced by lysis of leukemic cells and effect of drugs like asparaginase. To go further in the analyses of the role of tissue factor in thrombo-embolic events in acute lymphoblastic leukaemia we will first study the expression of tissue factor in lymphoblasts by qPCR, Western Blot and flow cytometry. High levels of circulating membrane microparticles have been associated with various diseases complicated by thrombosis. These microparticles derive from different origins and could expose phospholipids, conferring to those particles a procoagulant activity. Thus we will compare the capacity of lymphoblasts to generate microvesicles. To the best of our knowledge, there is no published study on that subject. We will next characterise those particles, if any, in terms of tissue factor. Thirdly, in order to investigate the functionality of Tissue Factor, we will measure the capacity of lymphoblasts and derived microparticles to generate Xa and thrombin generation thrombin (and Xa) assay. From these experiments we will have arguments to make a link between their pro-coagulant activity and anti-thrombin activity. It may lead to discuss the optimal prevention of thrombosis events as reinforced replacement therapy or new direct thrombin inhibitors that do not rely to anti-thrombin. Finally, in the last part of the Midy, we will study the incidence of thrombotic events according to recurrent cytogenetic abnormalities in acute lymphoblastic leukaemia. We may identify subgroups of acute lymphoblastic leukaemia associated with a higher rate of thrombotic complications. In this case we could study with a genome wide approach, loci variants in an effort to elucidate the molecular mechanisms contributing to an increased risk. In conclusion, these study may help to understand the mechanisms of thrombo-embolic events in acute lymphoblastic leukemia and to prevent and treat them more efficiently.