Etude des caractères génétiques des Entérovirus persistants dans les tissus cardiaques de sujets atteints de cardiomyopathie dilatée idiopathique

par Alexis Bouin

Projet de thèse en Sciences - STS

Sous la direction de Laurent Andreoletti.

Thèses en préparation à Reims , dans le cadre de Ecole doctorale Sciences, technologies, santé (Reims, Marne) , en partenariat avec (EPCH) Cardiovir Etude des caractères génétiques et Phénotypiques des entérovirus responsables de pathologies Cardiaques Humaines aigues et chroniques (laboratoire) depuis le 17-09-2012 .


  • Résumé

    Données de la littérature: Les Entérovirus (EVs) (Picornaviridae, 4 espèces A-D, 110 sérotypes humains) et plus spécifiquement les virus Coxsackies B (6 sérotypes, espèce-B) sont considérés comme la première cause infectieuse de myocardite de l'enfant et de l'adulte jeune. Ces virus à ARN sont également responsables de myocardites chroniques dont 10% vont évoluer vers le stade clinique de cardiomyopathie dilatée (CDM, 7 cas/100000 habitants). La CMD est actuellement la seconde cause clinique de transplantation cardiaque dans le monde. Le concept qu'une infection persistante à Enterovirus (EVs), puisse être responsable du développement d'une CMD est supporté par la détection de l'ARN génomique viral et de la persistance de l'expression des proteines virales de capside dans le tissu cardiaque de 35% des explants cardiaques de sujet atteints de CMD (Andréoletti 2000, Li 2000, Andréoletti et al , 2007). Problématique: Les mécanismes moléculaires viraux impliqués dans la progression de la myocardite aiguë vers le stade chronique de cardiomyopathie dilatée ne sont pas élucidés limitant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques contre les pathologies cardiaques humaines aiguës et chroniques à EVs. Hypothèse: En 2008 des formes virales cardiaques déletées en 5'NC du génome viral (virus Coxsackie B2) capable d'induire la synthèse protéique virale (protéines de capside et protéases virales) mais associées à une réplication lente, ont été découvertes dans un cas de myocardite aiguë fulminante au Japon (Chapman et al., 2008) Comme l'expression persistante des protéines virales dont la protéases 2-A seule est suffisante pour l'induction d'une cardiomyopathie chez la souris et que la détection des formes virales délétées est reliée à une infection persistante, ces dernières données virologiques obtenues chez l'homme suggèrent l'existence d'un nouveau modèle moléculaire de persistance virale capable d'expliquer le passage de la myocardite aiguë au stade chronique de cardiomyopathie dilatée. Objectifs: Les deux objectifs principaux de notre programme de recherche sont: (i) de déterminer et de comparer les caractères génétiques et phénotypiques des formes virales cardiaques délétées dans des cas de myocardites et de CMD ; (ii) d'étudier l'impact clinique des formes virales délétées sur l'évolution clinique du stade aiguë à la phase chronique de la myocardite à EVs. (Phase II). Les objectifs secondaires sont: (i) d'isoler à partir des tissus cardiaques biopsiques de sujets souffrant de myocardite ou de DCM des souches virales cardiotropes (délétées et non délétées) et d'identifier leurs caractères phénotypiques par des tests in vitro (tests de fitness sur culture cellulaire) et vivo (modèle souris DBA/2) (collaboration Dr S Tracy, Omaha-University); (ii) d'évaluer à partir de ces souches virales, une nouvelle stratégie antivirale utilisant des molécules (Ribavirin, 5FU amiloride) capables de diminuer l'infectivité virale cardiaque en augmentant le taux d'erreur de la polymérase virale 3D- (phase III, collaboration Dr M Vignuzzi) Stratégie scientifique: Phase I: Analyse rétrospective d'une banque de tissus cardiaques (4 fragments anatomiques par cœur étudié) fixés en PFA et inclus en paraffine de patients (âge>15ans, analyse histologique cardiaques suivant la classification histologique de Dallas) atteints de myocardiques (15 cas) ou de CMD (60 cas) (CHU de Reims Pr Paul Fornes, Hôpital européen Georges Pompidou, Pr P Bruneval Paris) permettant ainsi de réaliser l'étude génétique virale et l'étude de l'expression endomyocardique des protéines de capside virales. Phase II: Analyse longitudinale prospective sur 4 ans avec suivi cardiologique et échocardiographie d'une cohorte des sujets souffrant de myocardite aiguë (n=15) et de CMD (n=60) avec détection moléculaire des formes virales délétées et mise en culture des tissus cardiaques biopsiques sur des lignées de cellules humaines cardiaques (lignées HCF et WI38 (ATCC)) (Service de cardiologie du CHU de Reims, Pr D Metz et Dr Lesaffre; Service des maladies infectieuses du CHU de Reims; Pr C STRADY, Dr Y Nguyen). Résultats attendus : Ce programme de recherche permettra de préciser la fréquence de détection des formes virales délétés en 5'NC et leur localisation anatomique cardiaque, d'identifier les sérotypes impliqués (génotypage moléculaire), de comparer les résultats obtenus entre des patients souffrant de myocardite aiguë et ceux souffrant de CMD et de préciser l'impact clinique des formes virales délétées dans les maladies inflammatoires cardiaques. Par ailleurs nous développerons et validerons un système de culture cellulaire original qui autorisa la culture des souches virales délétées et l'évaluation de leurs caractéristiques phénotypiques. L'isolement de ces souches virales délétées permettra de comparer par rapport aux formes non délétées leur virulence et leur fitness mais aussi d'évaluer in vitro et in vivo (modèle murin DBA/2 de myocardite induite par les EVs humains ; Andréoletti et al, 1995).de nouvelles approches thérapeutiques visant à diminuer l'infectivité virale cardiaque en augmentant le taux d'erreur de la 3D-polymérase et donc la diversité génétique Conclusions et perspectives: Ce projet d'équipe basée sur une thématique de recherche « clinico-biologique » permettra de déterminer les caractèristiques génétiques (identification moléculaire et origine génétique) et phénotypiques (Fitness et virulence in vitro et in vivo) des formes enterovirales délétés dans les phases cliniques de myocardite et de CMD. Les résultats obtenus seront d'un intérêt majeur pour le développement de futures stratégies antivirales contre les infections cardiaques et les infections persistantes par les EVs humains.

  • Titre traduit

    Investigation of persistent Enterovirus genotypic characteristics in human cardiac tissue with idiopathic dilated cardiomyopathy


  • Résumé

    Background: Human enteroviruses (HEVs), especially coxsackieviruses B (CVB), are considered to be a common infectious cause of acute myocarditis in children and young adults and are implicated in the pathogenesis of dilated cardiomyopathy (DCM) (7 cases/ 100 000 habitants), which is the second most frequent clinical condition leading to heart transplantation. The concept that endomyocardial persistent HEV infection is the etiological cause of a subset of idiopathic DCM cases is supported by the detection of enterovirus genomic sequences and enteroviral capsid protein VP1 in up to 35 % of explanted heart tissues from end-stage DCM patients. However, the molecular mechanisms by which HEVs cause human myocarditis and progression to DCM remains poorly understood, therefore limiting the development of specific therapeutic strategies against HEV-induced acute and chronic heart diseases. Hypothesis: In 2008, Chapman et al. reported for the first time that CVB could generate unsuspected 5' terminal genomic deletions (TDs) during replication in the human cardiac tissue subsequent to a naturally occurring infection associated with a case of fatal myocarditis. As persistent expression of CVB proteins and 2Aprotease (2Apro) alone are sufficient for induction of cardiomyopathy in the mouse and as detection of HEV TD genomes in adult human heart disease is likely due to persistent HEV TD genomes, there is now a new hypothetical mechanism to link of acute viral myocarditis with postviral DCM. The two main objectives of this proposal are (i): to determine and to compare the genotypic and phenotypic characteristics of the 5' terminally-deleted (TD) HEV cardiac populations in human myocarditis and DCM cases; (ii) to assess the clinical impact of the 5' terminally-deleted (TD) HEV cardiac populations in the course of the inflammatory disease and on the outcome by performing a 4-year prospective clinical follow-up of the myocarditis and DCM patients infected by TD HEV forms comparatively to uninfected patients The two secondary objectives are: (i) To develop a new cell culture isolation technique of TD HEV forms in cardiac tissues and to test their phenotypic characteristics in vitro systems (fitness and replicative capacity) and in an EV-induced chronic myocarditis murine model (Andreoletti et al., 1995); (ii) secondary to the isolation of the TD HEV strains, to develop and to evaluate a new antiviral strategy based on the use of drugs (Ribavirin, 5FU, amiloride) capable of reducing the endomyocardial viral RNA infectivity by increasing the mutation/error rate of the viral 3D-polymerase (collaboration with Dr M. Vignuzzi, Pasteur institute of Paris). Scientific strategy: Phase I: Retrospective molecular (RNA genomic viral detection, genetic typing, phylogenetic comparison) and histopathological (cardiac expression of VP1 viral capsid protein) analyses of a collection of formalin-fixed, paraffin-embedded archival human heart tissues from 60 DMC and of 15 myocarditis cases [Department of Pathology, Georges Pompidou European Hospital (1999-2009), Pr P Bruneval]. [Department of Pathology, CHU of Reims, Pr P Fornes]. Phase II: Cardiac biopsy samples from patients with myocarditis (n=15) and with DCM (n=60) will be prospectively sampled (Reims university centre, cardiology department, Pr D Metz, Dr Lesaffre) in order to test the genetic diversity [quasi-species analyses by molecular approach (5)] and to develop a new cell culture isolation of TD viral forms; moreover a prospective clinical follow-up study of these patients will be performed during 4 years (Pr D Metz , Dr Lesaffre, Dept of Cardiology; Pr C Strady, Dr Y Nguyen, Dept of Infectious Diseases). Expected results: This research project will provide answers to the following questions: - How often are TD HEV populations detected in inflammatory human heart disease? - What serotypes are detected in human heart disease? - Does inoculation of mice with CVB3-TD alone without parental virus, lead to DCM? - What is the clinical impact of cardiac TD viral forms in humans? - Is reduction of viral RNA genetic diversity an exploitable approach to fight cardiac infections by HEVs as well as perhaps other RNA positive strand viruses? Conclusions: This research project will determine the role of HEV-TD populations in the pathophysiological development of acute and chronic inflammatory human heart diseases. Moreover, if such persistent and attenuated TD HEV forms could be responsible for various chronic HEV-related diseases, such virus populations would represent an appealing target for new therapies.