Reconnaissance moléculaire : de l'in silico à l'in vitro, et vice versa

par Simon Huet

Thèse de doctorat en Biomolécules pharmacologie thérapeutique

Sous la direction de Yves-henri Sanejouand.

Thèses en préparation à Nantes en cotutelle avec l'Unité de fonctionnalité et ingénierie des protéines (Nantes) , dans le cadre de Biologie - Santé , en partenariat avec Affilogic SAS (entreprise) depuis le 01-01-2013 .


  • Résumé

    La reconnaissance moléculaire, ou formation spécifique de complexes entre molécules par l'intermédiaire d’interactions physico-chimiques, est un mécanisme d’action fondamental des protéines appliquées à un usage médical. Dans cette étude, nous explorons l'ingénierie rationnelle de cette fonction avec comme partenaire une nouvelle classe de protéines destinée à développer les médicaments de demain: les Nanofitines (NF). Dans l’objectif de guider les approches expérimentales (in vitro) par celles prédictives (in silico) dans une collaboration réciproque, ce manuscrit décrit successivement deux preuves de concept appliquées à des NF dirigées contre la protéine de fluorescence verte (GFP). La première approche, conçue pour l’humanisation de NF par transfert sur des protéines humaines, a consisté à isoler 11 résidus fonctionnels à greffer à partir de NF anti-GFP générées par ribosome display. Le squelette du feuillet beta exposant ces acides aminés clés a ensuite été recherché dans une banque structurale pour identifier trois protéines humaines hôtes arborant un feuillet similaire (RMS ≤ 0,63Å). Une fois greffées des résidus clés des NF, ces protéines ont démontré une insolubilité ou une absence de fixation détectable à la GFP, contrairement à un homologue structural des NF. La seconde approche a visé à réaliser le design de novo de NF anti-GFP par modélisation moléculaire. Cette démarche, proposée comme alternative rationnelle complémentaire du procédé de sélection in vitro, a abouti à la découverte d’une NF dont l’épitope ciblé s’avère compatible avec les prédictions réalisées. Cette stratégie nécessitera d’être complétée afin d’optimiser l’affinité des NF générées de novo.

  • Titre traduit

    Molecular recognition : from in silico to in vitro, and vice versa


  • Résumé

    Molecular recognition, or specific complex formation between molecules through physico-chemical interactions, is one of the fundamental mechanisms of action of proteins intended for medical use. In this study, we have explored the rational engineering of this function involving a new class of proteins doomed to be part of the drugs of tomorrow: the Nanofitins. In order to guide experimental approaches (in vitro) by the predictive ones (in silico) in a mutual collaboration, this manuscript describes two successive proofs of concept applied to Nanofitins specifically directed towards green fluorescent protein (GFP). The first approach was designed to generate humanized Nanofitins following the transfert of their scaffold onto the surface of human proteins, and involved the isolation of 11 functional residues to be grafted from anti-GFP Nanofitins generated by ribosome display. The backbone of the beta-sheet displaying these key amino acids was then sought in a structural protein data bank to identify three human protein hosting a similar sheet (RMS ≤ 0.63Å). Upon grafting of Nanofitin’s key residues, these proteins demonstrated insolubility or lack of detectable binding to GFP, unlike a structural homologue of Nanofitins. The second approach aimed to perform the de novo design of anti-GFP Nanofitins by molecular modeling. This method, proposed as a rational alternative complementing the current in vitro selection process, has led to the discovery of a Nanofitin whose targeted epitope appears to be consistent with computated predictions. This strategy will need to be completed in order to optimize the affinity of the de novo generated Nanofitins.