Étude de la duplication du domaine V3 de la région NS5A du virus de l’hépatite C de génotype 1b : épidémiologie clinique et moléculaire et aspects fonctionnels.

par Hélène Le Guillou-Guillemette (Le Guillou)

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Françoise Lunel-Fabiani.

Thèses en préparation à Angers , dans le cadre de École doctorale 502 Biologie-Santé (Nantes-Angers) , en partenariat avec Hifih upres ea 3859 (laboratoire) depuis le 15-12-2006 .


  • Résumé

    L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) est responsable d’hépatite chronique, de cirrhose et de carcinome hépatocellulaire (CHC). La protéine NS5A du VHC participe à la réplication et l’assemblage viral, et à l’oncogenèse. Notre étude a caractérisé un polymorphisme du domaine V3-NS5A du VHC de génotype 1b, découvert au laboratoire. Nous avons identifié une duplication en tandem sans rupture d’ORF du domaine V3 avec une prévalence de 3,05%. Cette prévalence augmentait avec la sévérité de la pathologie hépatique (de 3.0% groupe sans cirrhose jusqu’à 9.4% groupe cirrhose et CHC, p de tendance=0.045). L’analyse des polymorphismes des séquences directes et clonales a montré que les souches dupliquées constituaient la totalité de la quasi-espèce et persistaient au moins 10 ans. Le mécanisme de duplication serait une recombinaison non-homologue entre souches de 2 populations sauvages. Nos résultats fonctionnels préliminaires ont suggéré des protéines partenaires spécifiques des protéines NS5A dupliquées par un crible en système double-hybride levure. Nous avons réalisé la production des protéines NS5A dupliquées en systèmes cellulaire et bactérien, avec une optimisation en système bactérien. Les premiers tests de pull down n’ont pas encore permis de valider les interactions. Nous avons identifié une duplication partielle V3-NS5A chez le VHC1b (i) potentiellement impliquée dans la carcinogenèse, (ii) présente durant l'intégralité de l’infection, (iii) issue d’une recombinaison non-homologue, évènement encore jamais décrit chez le VHC in vivo. Nos travaux ont aussi permis l’identification de partenaires cellulaires et la production des protéines NS5A dupliquées.


  • Résumé

    The hepatitis C virus (HCV) infection leads to chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The HCV NS5A protein has been shown to be involved in viral replication and assembly and in the liver carcinogenesis. We investigated a V3-NS5A polymorphism in HCV 1b identified in our laboratory. We found two V3 domains tandemly duplicated without ORF disruption in 3.05% of the HCV sequences. The prevalence of this duplication increased with liver disease severity (from 3.0% in patients without cirrhosis to 9.4% in patients with both cirrhosis and HCC, p for trend=0.045). Direct sequencing and clonal analyzes showed that quasispecies were entirely composed by mutants strains that persisted at least for 10 years. These V3 duplications were likely resulting from a non-homologous recombination that occurred between two wild-type strains. Our preliminary functional results identified potential specific interactions between host-cell proteins and the V3-NS5A duplicated proteins using a yeast two-hybrid system. We expressed recombinant duplicated NS5A proteins in cell and bacterial cultures and developed an optimized protocol for bacterial cultures. A validation of the interactions has not been reached with the first pull-down assays. We identified a V3-NS5A duplication in HCV 1b for the first time (i) associated with unfavorable evolution of liver disease including a possible involvement in liver carcinogenesis (ii) always present during the HCV infection (iii) resulting from a non-homologous recombination, mechanism that has never been described in vivo in HCV. We also suggested potential specific protein-protein interactions and performed recombinant NS5A protein production.