Caractérisation des mécanismes moléculaires de TXNDC5 et de son rôle dans la réponse au squalène à l'aide de divers systèmes d'administration de médicaments dans la lignée cellulaire AML12

Characterization of Molecular Mechanisms of TXNDC5 and Its Role in Squalene Response Using Various Drug Delivery Systems in the AML12 Cell Line

• Auteur / Autrice : Seyed Bidooki
• Direction : Susana De matos fernandes, Jesus de la Osada
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Aspects moléculaires
• Date : Soutenance en 2025
• Etablissement(s) : Pau en cotutelle avec Université de Saragosse (UNIZAR)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Exactes et leurs Applications
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des sciences analytiques et de Physico-chimie pour l'Environnement et les Matériaux
• Jury : Président / Présidente : Maria Jesus Moreno aliaga
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Susana De matos fernandes, Jesus De La Osada garcia, Maria Angeles Navarro fernando, Mario Ollero ojeda, Ana Cenarro lagunas
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Maria Jesus Moreno aliaga, Mario Ollero ojeda

Mots clés

Mots clés libres

Squalene

Txndc5

Nanoparticle

Masld

Drug delivery

Résumé

Maladie hépatique stéatosique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD), anciennement connue sous le nom de stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est induite par l'accumulation de graisse dans le foie. Le stress du réticulum endoplasmique (RE), le stress oxydatif et le dysfonctionnement mitochondrial sont des éléments nécessaires au développement de la MASLD. La protéine qui contient la thioredoxine de type 5 (TXNDC5) est un membre de la famille des thioredoxines et joue un rôle central en tant que chaperon du RE impliqué dans le maintien de l'homéostasie cellulaire dans des conditions de stress. L'objectif de cette étude était d'étudier les effets du TXNDC5 sur l'action du squalène, un antioxydant naturel présent dans l'huile d'olive vierge, délivré par divers systèmes d'administration de médicaments pour améliorer sa biodisponibilité. Le squalène a été encapsulé dans des nanoparticules de PLGA et de chitosane dans le but d'améliorer son absorption cellulaire dans les cellules AML12 (foie de souris alpha) et les cellules AML12 déficientes en TXNDC5 (KO) produites par la technologie CRISPR/Cas9. La caractérisation des nanoparticules par microscopie électronique, diffusion dynamique de la lumière, analyse du potentiel zêta et chromatographie liquide haute performance a confirmé l'encapsulation et l'inclusion efficaces du squalène à différentes concentrations. L'encapsulation du squalène dans des nanoparticules de chitosane a démontré une absorption cellulaire significativement améliorée par rapport aux vecteurs de médicaments PLGA et éthanol. Cela permet l'administration de doses plus élevées, qui améliorent la viabilité des hépatocytes et réduisent les niveaux de ROS, compensant efficacement les effets indésirables du déficit en TXNDC5 dans le contexte de la protection contre le stress des hépatocytes. Les tests de viabilité cellulaire ont montré que TXNDC5 joue un rôle important dans la modulation de la viabilité cellulaire dans des conditions de stress oxydatif et ER, comme en témoigne le fait que le squalène réduit efficacement les ROS dans les cellules AML12 tout en augmentant les ROS dans les cellules déficientes en TXNDC5. Il a été observé que le squalène améliore la viabilité cellulaire dans des conditions de stress ER en diminuant l'expression des marqueurs de stress ER, notamment ERN1 et EIF2AK3, et en induisant l'expression de protéines protectrices telles que GPx4. Pour déterminer la fonction de TXNDC5 dans les lignées cellulaires AML12 et KO, la tunicamycine, l'acide palmitique et la thapsigargine ont été utilisés comme facteurs de stress. Les résultats de l'expression protéique des marqueurs de stress ER les plus importants ont révélé que parmi eux, les protéines ERN1 et EIF2AK3 étaient régulées à la baisse et HSPA5 était régulée à la hausse. La tunicamycine a perturbé les niveaux de protéines de HSPA5, ERN1 et EIF2AK3 dans les cellules KO. L'acide palmitique a modifié les niveaux de protéines des capteurs de stress du RE, tels que ATF6, HSPA5 et EIF2AK3. TXNDC5 a interagi avec PRDX6 et HSPA9, des protéines impliquées dans la régulation redox de la peroxydation lipidique et du glutathion, et avec la perte de TXNDC5, ces voies ont des activités réduites, comme cela a été enregistré par la réduction de la peroxydation lipidique et du glutathion. En conclusion, ces résultats montrent que TXNDC5 est un modulateur de multiples voies de signalisation impliquées dans les stress oxydatifs et induits par le RE dans les hépatocytes, que le squalène, administré par l'intermédiaire de nanoparticules de PLGA et de chitosane, empêche l'action de ces stress et soutient son action protectrice par les implications thérapeutiques sous-jacentes de la modulation de TXNDC5 avec un système d'administration de médicaments ciblés pour protéger le foie.

Metabolic dysfunction–associated steatotic liver disease (MASLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is induced by fat accumulation within the liver. Endoplasmic reticulum (ER) stress, oxidative stress, and mitochondrial dysfunction are necessary elements in the development of MASLD. Thioredoxin domain-containing 5 (TXNDC5) is a member of the thioredoxin family and plays a pivotal role as an ER chaperone involved in maintaining cellular homeostasis in stress conditions. Nevertheless, the precise molecular mechanisms through which TXNDC5 exerts its effects on hepatocytes under conditions of oxidative and ER stress remain incompletely understood. The objective of this study was to investigate the effects of TXNDC5 on squalene action, a natural antioxidant found in virgin olive oil, delivered through various drug delivery systems to enhance its bioavailability. Squalene was encapsulated in PLGA and chitosan nanoparticles with the aim of enhancing its cellular uptake in AML12 (alpha mouse liver) cells and TXNDC5-deficient AML12 cells (KO) produced by CRISPR/Cas9 technology. Characterization of the nanoparticles by electron microscopy, dynamic light scattering, zeta potential analysis, and high-performance liquid chromatography confirmed efficient encapsulation and inclusion of squalene at different concentrations. The encapsulation of squalene in chitosan nanoparticles demonstrated a significantly enhanced cellular uptake in comparison to the PLGA and ethanol drug carriers. This enables the administration of higher doses, which enhance hepatocyte viability and reduce ROS levels, effectively compensating for the adverse effects of TXNDC5 deficiency in the context of hepatocyte stress protection. Cell viability assays showed that TXNDC5 has an important role in modulating cell viability under conditions of oxidative and ER stress, as evidenced by the fact that squalene effectively reduced ROS in AML12 cells while increasing ROS in TXNDC5-deficient cells. Squalene was observed to enhance cell viability under conditions of ER stress by decreasing the expression of ER stress markers, including ERN1 and EIF2AK3, and by inducing the expression of protective proteins such as GPx4. To ascertain the function of TXNDC5 in AML12 and KO cell lines, tunicamycin, palmitic acid, and thapsigargin were utilized as stressors. The results from protein expression of the most prominent ER stress markers revealed that among them, the proteins ERN1 and EIF2AK3 were downregulated and HSPA5 was upregulated. Tunicamycin has disrupted the protein levels of HSPA5, ERN1, and EIF2AK3 in KO cells. Palmitic acid modified the protein levels of the ER stress sensors, such as ATF6, HSPA5, and EIF2AK3. TXNDC5 interacted with PRDX6 and HSPA9, proteins involved in the redox regulation of lipid peroxidation and glutathione, and with the loss of TXNDC5, these pathways do have reduced activities, as was recorded by reduced lipid and glutathione peroxidation. Thereby, loss of TXNDC5 impacted mitochondrial functions and specifically disrupted the mRNA levels coding genes that participate in an oxidative stress response and protein folding process. In conclusion, these findings show that TXNDC5 is a modulator of multiple signaling pathways involved in oxidative and ER-induced stresses in hepatocytes, which squalene, given through PLGA and chitosan nanoparticles, prevents the action of these stresses and supports its protective action by the underlying therapeutic implications for modulation of TXNDC5 with a drug-target delivery system to protect the liver.