Contractilité supracellulaire des myofibroblastes dans l'homéostasie du côlon et la cicatrisation

Supracellular contractility of myofibroblasts in colon homeostasis and wound healing

• Auteur / Autrice : Neda Glisovic
• Direction : Danijela Matic vignjevic
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2021
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie Cellulaire et Cancer
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Migration et invasion cellulaire
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie

Mots clés

Mots clés libres

Myofibroblastes

Côlon

Cicatrisation

Myofibroblasts

Colon

Wound healing

Résumé

La contractilité cellulaire remplit des fonctions physiologiques essentielles telles que la contraction musculaire et la migration cellulaire, mais joue également un rôle dans plusieurs maladies humaines, notamment la fibrose, la cicatrisation et le cancer. Outre les cellules musculaires, les myofibroblastes constituent un autre type de cellules contractiles professionnelles. Ils partagent avec les cellules musculaires certains marqueurs spécifiques (alpha-smooth muscle actin- aSMA) qui les dotent de capacités contractiles particulières. Dans la plupart des cas, les myofibroblastes sont des entités transitoires censées naître des fibroblastes normaux à la suite d'un stress et dont la fonction est de remodeler le tissu conjonctif en se contractant et en tirant sur la matrice extracellulaire (MEC). Un tel processus est, par exemple, nécessaire pour réparer un épithélium blessé. Une fois la blessure réparée, les myofibroblastes meurent normalement. S'ils persistent plus longtemps, la contraction excessive et le remodelage excessif de la MEC qui en résulte entraînent la formation de cicatrices. Ces cellules hautement contractiles sont toujours présentes là où un remodelage substantiel de la matrice se produit. Cependant, les myofibroblastes sont également présents dans de nombreux tissus dans des conditions physiologiques, y compris dans l'intestin. Dans l'homéostasie intestinale, il n'y a pas de remodelage spectaculaire de la MEC, et le rôle des myofibroblastes dans ce contexte n'est pas clair. L'épithélium du côlon tapisse les cryptes qui descendent dans le tissu conjonctif sous-jacent. Les cellules souches en cours de division sont situées au fond des cryptes. Les cellules qui s'amplifient transitoirement se différencient et migrent vers le haut, vers le plateau du côlon, d'où elles sont rejetées dans la lumière. Associé aux cryptes, sous-jacent à la membrane basale épithéliale, se trouve un réseau de myofibroblastes. Les myofibroblastes jouent un rôle dans l'homéostasie intestinale en produisant des facteurs de croissance et des protéines de la MEC. Cependant, des fibroblastes normaux pourraient également remplir ces fonctions, comme c'est le cas dans d'autres organes. La raison pour laquelle l'intestin a besoin de l'équipement contractile spécial des myofibroblastes et la manière dont cela affecte l'homéostasie épithéliale et la réparation des plaies sont totalement inconnues. Données préliminaires : Pour identifier les myofibroblastes dans le côlon, nous avons croisé une souris rapporteuse Tomato/GFP avec une souris exprimant la recombinase CreERT2 sous le promoteur aSMA. Dans la souris composée (aSMA:Tomato/GFP), nous avons identifié deux populations de cellules morphologiquement distinctes, positives pour la GFP, autour des cryptes : 1) des cellules fusiformes avec des fibres de stress proéminentes enrichies en protéine aSMA ; et 2) des cellules stellaires connectées avec de longues protrusions dendritiques formant un réseau qui enveloppe étroitement les cryptes. Pour évaluer les différences entre les deux populations de myofibroblastes, nous avons réalisé une analyse RNA-seq unicellulaire sur les cellules immédiatement après leur isolement. Les données sont analysées en collaboration avec Genosplice. Nous avons identifié 6 sous-populations de fibroblastes dans la muqueuse intestinale, dont 3 groupes de myofibroblastes. En utilisant l'imagerie multiplex et des marqueurs uniques pour chaque sous-population, nous les avons localisées spatialement dans la muqueuse du côlon sain et blessé. Nous avons également généré un ensemble complet de données sur les régulateurs candidats des adhésions cellule-cellule et cellule-matrice, de la contractilité et de différentes protéines ECM. Cette thèse vise à disséquer le rôle de la contractilité des myofibroblastes dans l'homéostasie du côlon, les dommages épithéliaux et la réparation des blessures. Tout d'abord, nous caractériserons les myofibroblastes sous-épithéliaux dans la muqueuse du côlon en homéostasie. En utilisant des signatures moléculaires, nous finaliserons la cartographie spatiale des populations de myofibroblastes le long du tube intestinal. Nous caractériserons ensuite leur prolifération et leur dynamique et déterminerons s'ils fonctionnent comme des unités contractiles multicellulaires, en utilisant différents modèles de souris combinés à des expériences d'imagerie intravitale et de traçage de lignées. Nous aborderons ensuite le rôle des myofibroblastes dans l'homéostasie du côlon. La muqueuse colique est soumise à de nombreuses forces, dont la pression et la contrainte de cisaillement causées par un contenu luminal relativement non compressible. Nous avons observé que la muqueuse est fortement étirée pendant le transit fécal et que, si les cryptes deviennent plus courtes et plus larges, elles restent fermées et très compactes. Nous supposons que les myofibroblastes détectent la stimulation mécanique et y répondent en se contractant pour préserver l'intégrité de la crypte, protégeant ainsi le compartiment des cellules souches des agressions mécaniques. En ablatant génétiquement la myosine II dans les myofibroblastes, nous déterminerons si le manque de contractilité affecte l'intégrité de la crypte et les cellules souches dans un état stable et lors de dommages épithéliaux. Enfin, nous déterminerons le rôle des fibroblastes dans la réparation des plaies. En utilisant des modèles murins de réparation des plaies, nous étudierons la dynamique de différentes populations de fibroblastes, y compris les changements de prolifération, de migration, de contractilité et de distribution spatiale. Nous évaluerons ensuite le rôle de la contractilité dans la réparation des plaies en utilisant l'ablation génétique et pharmacologique de la contractilité des fibroblastes.

Cell contractility fulfills essential physiological functions such as muscle contraction and cell migration but also plays a role in several human diseases, including fibrosis, scarring, and cancer. Besides muscle cells, myofibroblasts are another type of professional contractile cell. They share with muscle cells some specific markers (alpha-smooth muscle actin- aSMA) that endow them with special contractile abilities. In most cases, myofibroblasts are transient entities believed to arise from normal fibroblasts following stress and whose function is to remodel the connective tissue by contracting and pulling on the extracellular matrix (ECM). Such a process is, for example, required to repair a wounded epithelium. Once the wound is repaired, myofibroblasts normally die. If they persist longer, the excessive contraction and the resulting over-remodeling of the ECM lead to scars' formation. These highly contractile cells are always present where substantial matrix remodeling is happening. However, myofibroblasts are also present in many tissues under physiological conditions, including the gut. In gut homeostasis, there is no dramatic remodeling of the ECM, and the role of myofibroblasts in this context is unclear. The epithelium of the colon lines the crypts that descend into the underlying connective tissue. Dividing stem cells are located at the bottom of the crypts. Transiently amplifying cells differentiate and migrate upward towards the colon's plateau from where they are shed into the lumen. Associated with crypts, subjacent to the epithelial basement membrane, lies a network of myofibroblasts. Myofibroblasts play a role in gut homeostasis by producing growth factors and ECM proteins. However, normal fibroblasts could also accomplish these functions, like it is the case in other organs. Why the gut needs the special contractile equipment of myofibroblasts and how this affects epithelial homeostasis and wound repair is entirely unknown. Preliminary data: To identify myofibroblasts in the colon, we have crossed a Tomato/GFP reporter mouse with a mouse expressing CreERT2 recombinase under the aSMA promoter. In the compound mouse (aSMA:Tomato/GFP), we have identified two morphologically distinct GFP-positive cell populations around crypts: 1) spindle-shaped cells with prominent stress fibers enriched with aSMA protein; and 2) stellate cells connected with long dendritic protrusions forming a network that tightly envelops the crypts. To assess the differences between two myofibroblasts populations, we have performed a single-cell RNA-seq analysis on cells immediately after isolation. Data is analyzed in collaboration with Genosplice. We identified 6 subpopulations of fibroblasts in the gut mucosa, including 3 clusters of myofibroblasts. Using multiplex imaging and unique markers for each subpopulation, we spatially localized them in the healthy and wounded colon mucosa. We have also generated a complete dataset of candidate regulators of cell-cell and cell-matrix adhesions, contractility, and different ECM proteins. This thesis aims to dissect the role of myofibroblasts' contractility in colon homeostasis, epithelial damage, and wound repair. First, we will characterize subepithelial myofibroblasts in colon mucosa in homeostasis. Using molecular signatures, we will finalize spatial mapping of myofibroblast populations along the intestinal tube. We will then characterize their proliferation and dynamics and determine if they function as multicellular contractile units, using different mouse models combined with intravital imaging and linage tracing experiments. Then, we will address the role of myofibroblasts in colon homeostasis. The colonic mucosa is subjected to numerous forces, including pressure and shear stress caused by relatively non-compressible luminal content. We have observed that mucosa becomes highly stretched during feces transit, and while crypts become shorter and wider, they remain closed and highly compact. We hypothesize that myofibroblasts sense mechanical stimulation and respond to it by contracting to preserve crypt integrity, protecting the stem cell compartment from mechanical insults. By genetically ablating myosin II in myofibroblasts, we will determine if lack of contractility affects crypt integrity and stem cells in a steady state and upon epithelial damage. Finally, we will determine the role of fibroblasts in wound repair. Using mouse models for wound repair, we will investigate the dynamics of different populations of fibroblasts, including change of proliferation, migration, contractility, and spatial distribution. We will then assess contractility's role in wound repair using genetic and pharmacological ablation of contractility in fibroblasts.