Rôle et origine de l'ADN extracellulaire dans la production et la structure des biofilms de Clostridioides difficile

Role and origin of extracellular DNA in the production and structure of Clostridioides difficile biofilms

• Auteur / Autrice : Tania Sorelle Kamwouo ngako
• Direction : Claire Janoir-jouveshomme, Sylvie Bouttier
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Inscription en doctorat le 30/09/2021
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : MICALIS- Microbiologie de l'Alimentation au service de la santé humaine
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)

Mots clés

Mots clés libres

ADN extracellulaire

Clostridioides difficile

Antibiorésistance

Biofilm

Autolyse

Génomique

Autolysis

Antibioresistance

Extracellular DNA

Biofilm

Clostridioides difficile

Genomics

Résumé

Clostridioides difficile est une bactérie responsable d'infections intestinales, survenant majoritairement après une antibiothérapie. La difficulté majeure pour la prise en charge de ces infections est la survenue fréquente de récidives, dont la moitié sont de vraies rechutes. In vitro, C. difficile forme des biofilms de biomasse variable selon les souches et plusieurs données suggèrent que la formation de biofilm par C. difficile pourrait être un mode de persistance au niveau colique. Le biofilm est une communauté microbienne structurée, englobée dans une matrice extrapolymérique, composée entre autres d'ADN extracellulaire (ADNe). L'ADNe a un rôle essentiel dans la stabilité des biofilms de nombreuses espèces bactériennes et participe à la résistance des bactéries sessiles vis-à-vis des défenses de l'hôte et des antibiotiques. La cinétique de production de l'ADNe au cours de la formation des biofilms (étapes précoce ou tardive) est variable en fonction des espèces, de même que les mécanismes mis en œuvre pour sa libération. Toutefois, dans le cas des biofilms, le mécanisme majeur de libération de l'ADNe semble être l'autolyse, médiée principalement par les peptidoglycanes hydrolases. La matrice des biofilms de C. difficile comprend également de l'ADNe. Nous avons confirmé que le biofilm mature produit par plusieurs souches est presque totalement dispersé après un traitement à la DNase I, et des essais préliminaires semblent montrer une association entre la capacité des souches à former un biofilm robuste et cohésif in vitro et leurs propriétés d'autolyse. L'objectif de cette thèse est donc d'étudier le rôle de l'ADNe dans la formation, la structure et les propriétés de résistance des biofilms de C. difficile et de déterminer les mécanismes sous-tendant la libération de ce composant. La première question scientifique posée dans le cadre de ce projet concerne le caractère “universel” ou non du rôle de l'ADNe dans la cohésion et de la stabilité du biofilm de C. difficile. Pour y répondre, nous étudierons la capacité à produire des biofilms d'un large panel de souches cliniques, ainsi que le rôle de l'ADNe dans la structure de ces biofilms. La deuxième question scientifique porte sur la cinétique de libération de l'ADNe au cours de la formation du biofilm de C. difficile. Nous étudierons les biofilms de 2 souches à différents temps (par quantification de la biomasse et étude de l'architecture par microscopie confocale) après traitement ou non par la DNase I et nous quantifierons l'ADNe dans la matrice extrapolymérique aux différents temps testés. La combinaison de ces différentes techniques nous permettra d'identifier l'étape (ou les étapes) où la production d'ADNe est la plus importante. Nous étudierons ensuite le mode de libération de l'ADNe dans la matrice des biofilms de C. difficile, grâce à deux approches complémentaires : i) l'hypothèse d'une libération d'ADNe par l'autolyse étant privilégiée, nous construirons des souches mutées pour 2 gènes connus d'autolysines et le phénotype des biofilms produits par ces mutants sera analysé ; ii) en parallèle, nous ferons le transcriptome des bactéries incluses dans le biofilm aux étapes majeures de libération de l'ADNe, afin d'identifier les principaux gènes impliqués dans ce mécanisme. Les gènes les plus pertinents seront ensuite mutés et les biofilms des mutants ainsi produits seront caractérisés phénotypiquement (biomasse, architecture, composants de la matrice). Enfin, nous étudierons le rôle de l'ADNe dans les propriétés de résistance du biofilm aux agents antibactériens. En conclusion, ce travail permettra de comprendre le rôle de l'ADNe dans la formation et la stabilité des biofilms de C. difficile et d'ouvrir ainsi la voie au développement d'approches thérapeutiques innovantes pour lutter contre la survenue des rechutes des infections à C. difficile par dispersion du biofilm.

Clostridioides difficile is a bacterium responsible for intestinal infections, mostly occurring after antibiotic therapy. The major difficulty encountered in the management of these infections is the frequent occurrence of recurrences, which, for about half of them, are true relapses. In vitro, C. difficile forms biofilms with variable biomass depending on the strain, and several data suggest that the formation of biofilm by C. difficile could be a mode of persistence at the colonic level. The biofilm is a structured microbial community, enclosed in an extrapolymeric matrix, comprising several components, including extracellular DNA (eDNA). eDNA plays an essential role in the stability of the biofilms formed by many bacterial species and is also partly responsible for the resistance of sessile bacteria to host defenses and antibiotics. Kinetics of eDNA production during biofilm formation (at early or late stages) varies depending on the species, as do the mechanisms of its release. However, in the case of biofilms, the major mechanism of eDNA release appears to be autolysis, mediated primarily by peptidoglycan hydrolases. The C. difficile biofilm matrix also contains eDNA. We have confirmed that the mature biofilm produced by several strains is almost completely dispersed after treatment with DNase I, and preliminary tests showed an association between the ability of strains to form a robust and cohesive biofilm in vitro and their properties of autolysis. The objective of this thesis is therefore to study the role of eDNA in the formation, the structure and resistance properties of C. difficile biofilms and to determine the mechanisms underlying its release. The first scientific question concerns the “universal” nature or not of the role of eDNA in the cohesion and stability of the C. difficile biofilm. To address this question, we will study the ability to produce biofilms of a large panel of clinical strains, as well as the role of eDNA in the structure of these biofilms. The second scientific question concerns the kinetics of eDNA release during the formation of the C. difficile biofilm. We will study the biofilms of 2 strains at different times (by quantification of the biomass and study of the architecture by confocal microscopy) after treatment or not with DNase I, and we will quantify the eDNA included in the extrapolymeric matrix at the different times tested. The combination of these different techniques will allow us to identify the stage or stages where eDNA production is most important. We will then study the mode of release of eDNA in the matrix of C. difficile biofilms, thanks to two complementary approaches: i) as the hypothesis of an eDNA release following bacterial autolysis is privileged, we will construct mutant strains for 2 autolysin genes and the phenotype of the biofilms produced by these mutants will be analyzed; ii) in parallel, we will perform the transcriptome of the bacteria included in the biofilms at the major stages of eDNA release, in order to identify the main genes involved in this mechanism. The most relevant genes will then be mutated and the biofilms of the mutants will be further characterized phenotypically (biomass, architecture, matrix components). Finally, we will study the role of eDNA in the properties of resistance of biofilm to antibacterial agents. In conclusion, this work will allow a better understanding of the role of DNA in the formation and stability of C. difficile biofilms and this will pave the way for the development of innovative therapeutic approaches to limit the occurrence of relapses by dispersing the C. difficile biofilm.