Greatwall/ENSA/PP2A B55: une nouvelle voie clé dans le contrôle de la progression en phase S et dans le checkpoint dommage à l'ADN

Greatwall/ENSA/PP2A B55: A new key pathway in the control of S phase Progression and the DNA damage Checkpoint

• Auteur / Autrice : Fenosoa sylvia Rasamizafy
• Direction : Anna Castro, Thierry Lorca
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le 11/01/2021
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-….)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : CRBM - Centre de Recherche en Biologie cellulaire de Montpellier
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Contrôle de l'entrée et la progression mitotiques

Mots clés

Mots clés libres

Cycle cellulaire

Greatwall

Tresline

E3 Ubilitine ligases

Réplication de l'ADN

PP2A-B55 phosphatase

Cell cycle

Greatwall

Treslin

E3 Ubilitin ligases

DNA replication

PP2A-B55 phosphatase

Résumé

Une réplication fidèle et hautement régulée de l'ADN est essentielle pour garantir l'intégrité du génome. La réplication de l'ADN commence par la localisation du complexe de reconnaissance des origines (ORC) au niveau des séquences des origines de réplication à la fin de la mitose et au début de la G1. Ensuite, les protéines Cdt1 et Cdc6 y sont recrutées, permettant le chargement ultérieur du complexe MCM 2-7. Cet assemblage de protéines est appelé le complexe de pré-réplication (pre-RC). À la fin de G1, l'activation de Cdk favorise la phosphorylation de Treslin et recrute TopBP1 et Cdc45 au niveau du pré-RC, ce qui entraîne l'activation de l'hélicase MCM et le déclenchement des origines de réplication (ou origin firing). La phosphorylation est une modification pivot pour la régulation du cycle cellulaire. Pendant la mitose, l'activation de Cyclin B-Cdk1 déclenche une cascade de phosphorylations nécessaires à l'entrée en mitose. Ces phosphorylations sont contrebalancées par la phosphatase PP2A-B55. Il est intéressant de noter que l'activité de PP2A-B55 est inhibée par la cascade Gwl/Arpp19-ENSA. Lors de la transition G2-M, l'activation de CyclinB/Cdk1 favorise la phosphorylation de Gwl et de ses substrats Arpp19 et ENSA. Une fois phosphorylées, ces deux protéines se lient étroitement à PP2A-B55 et favorisent l'inhibition de la phosphatase permettant la phosphorylation stable des substrats de Cyclin B/Cdk1 et l'entrée en mitose. Outre la mitose, nos données montrent également un rôle de la voie Gwl dans le contrôle de la réplication de l'ADN. Nous avons montré que la déplétion d'ENSA favorise la déphosphorylation de Treslin, sa dégradation ultérieure et l'extension de la phase S. De plus, nos données non publiées montrent que, en l'absence d'ENSA, les niveaux de la protéine Timeless (Tim) sont également diminués. Timeless est une sous-unité du Fork Protection Complex (FPC) formé par Timeless, Tipin et Claspin. Ce complexe participe à la stabilisation de la fourche, en particulier dans les régions difficiles à répliquer (DTRR) et son inactivation conduit à l'activation du point de contrôle des dommages à l'ADN. Des études structurales récentes indiquent également que Csm3/Tof1 et Mrc1, l'orthologue de Tipin chez la levure, Tim et Claspin contribuent à la pause de la fourche en stabilisant l'hélicase Cdc45-MCM-Gims (CMG) pendant la Sphase. En effet, nos données suggèrent également que la diminution des niveaux de Tim est associée aux cassures simple brin et double brin (ss ou dsDNA). De façon surprenante, ce phénomène est indépendant de la Treslin, c'est-à-dire que la surexpression de la Treslin dans les cellules dépourvues d'ENSA ne sauve pas les niveaux de Tim et ne prévient pas les dommages à l'ADN dans ces cellules. L'objectif principal de cette thèse sera l'identification du rôle de l'axe Gwl/ENSA/PP2A-B55 sur le maintien du complexe de protection de la fourche de réplication, son stabilité et son implication dans la progression de la phase S.

Faithfull and highly regulated DNA replication is essential to ensure genome integrity. DNA replication starts by the engagement of Origin Recognition Complex (ORC) into the replication origins sequences during late mitosis/early G1. Then, Cdt1 and Cdc6 proteins can be localized into this location permitting the subsequent loading of the MCM 2-7 complex. This protein assembly is called the pre-replication complex (pre-RC). At late G1, Cdk activation promotes the phosphorylation of Treslin and recruits TopBP1 and Cdc45 at the pre-RC resulting in the activation of MCM helicase and replication origin firing. Phosphorylation is a pivotal modification for cell cycle regulation. During mitosis, Cyclin B-Cdk1 activation triggers a cascade of phosphorylations required for mitotic entry. These phosphorylations are counterbalanced by the PP2A-B55 phosphatase. Interestingly, PP2A-B55 activity is inhibited by the Gwl/Arpp19-ENSA cascade. At the G2-M transition, CyclinB/Cdk1 activation promotes the phosphorylation of Gwl and of its substrates Arpp19 and ENSA. Once phosphorylated, these two proteins tightly bind PP2A-B55 and promote the inhibition of the phosphatase permitting the stable phosphorylation of Cyclin B/Cdk1 substrates and mitotic entry. Besides mitosis, our data also shows a role of the Gwl pathway in the control of DNA replication. We showed that depletion of ENSA promotes the dephosphorylation of Treslin, its subsequent degradation and the extension of S phase. Furthermore, our unpublished data show that, in the absence of ENSA, the levels of Timeless (Tim) protein are also decreased. Timeless is a subunit of Fork Protection Complex (FPC) formed by Timeless, Tipin and Claspin. This complex participates to fork stabilization specifically in Difficult To Replicate Regions (DTRRs) and its inactivation leads to DNA damage checkpoint activation. Recent structural studies also indicate that Csm3/Tof1 and Mrc1, yeast orthologue of Tipin, Tim and Claspin help to pause the fork by stabilizing Cdc45-MCM-Gims (CMG) helicase during Sphase. Indeed, our data also suggest that Tim decreased levels are associated with single strand and double strand breaks (ss or dsDNA). Surprisingly, this phenomenon is Treslin independent i.e. Treslin surexpression in ENSA depleted cells does not rescue Tim levels or prevents DNA damage in these cells. The main aim of this PhD will be the identification of the role of the Gwl/ENSA/PP2A-B55 axis in the maintenance of the fork protection complex and replication fork stability and its involvement in S phase progression.