Variants associés au cancer dans les régions désordonnées de BRCA2: impact en mitose et en méiose

par Rania Ghouil

Projet de thèse en Biochimie et biologie structurale

Sous la direction de Sophie Zinn.

Thèses en préparation à université Paris-Saclay , dans le cadre de École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (laboratoire) et de Faculté de pharmacie (référent) depuis le 30-09-2020 .


  • Résumé

    La protéine de susceptibilité au cancer du sein BRCA2 participe à la réparation de l'ADN par recombinaison homologue (RH) pendant les phases S/G2 du cycle cellulaire : elle interagit avec les protéines de recombinaison RAD51 et DMC1, ce qui facilite la RH dans les cellules mitotiques et méiotiques (Jensen et al., 2010 ; Martinez et al., 2016 ; Brandsma et al., 2019). En mitose, elle se lie également à BUBR1, qui est un composant du point de contrôle de l'assemblage des fuseaux mitotiques. À la fin de la mitose, elle se localise dans le corps central et facilite la division cellulaire en servant de protéine d'échafaudage pour les composants centraux du fuseau. Plusieurs mutations dans le gène codant pour le BRCA2 provoquent une instabilité du génome et sont associées aux cancers du sein et de l'ovaire. Malgré les connaissances accumulées sur les fonctions des BRCA2, les mécanismes moléculaires associés à ces fonctions sont mal décrits. Cela est dû en partie au caractère désordonné de BRCA2, qui ne permet pas l'identification de régions bien repliées avec des cibles définies. Parmi les 3418 aa de BRCA2, un seul domaine globulaire a été identifié, qui se lie à l'ADN simple brin (ssDNA) et à la petite protéine désordonnée DSS1, comme observé dans la structure 3D de ce domaine en complexe avec un oligo(dT)9 et DSS1 (Yang et al., 2002). Deux petits fragments de BRCA2 à forte propension au désordre ont été capturés par cristallographie aux rayons X lorsqu'ils sont liés à PALB2 ou RAD51 (Oliver et al., 2009 ; Pellegrini et al., 2002). Grâce à ces interactions, BRCA2 coordonne les activités des facteurs de recombinaison DSS1 et PALB2 pour favoriser la fixation de RAD51 sur l'ADN simple brin et son activité pendant la RH. Les interactions impliquant des régions désordonnées restent difficiles à identifier car les sites de liaison ne peuvent être prévus avec précision à l'aide d'outils bioinformatiques. Pourtant, l'absence de sites de liaison bien structurés offre des possibilités fonctionnelles uniques à BRCA2, qui peut se lier à un grand ensemble de partenaires de manière étroitement régulée. Notre équipe a entamé l'analyse structurale des interactions entre plusieurs régions désordonnées et conservées de BRCA2 et leurs partenaires. L'objectif est d'identifier l'impact des variants de BRCA2 détectés chez les patients atteints de cancers du sein et de l'ovaire (figurant dans la base de données nationale UMD-BRCA2) sur ces interactions et les défauts fonctionnels associés. Une première interaction avec la kinase Plk1 a été prédite à partir d'une analyse RMN et bioinformatique de BRCA2(167-270), sa validation expérimentale à la fois in vitro et en cellules a été réalisée en collaboration avec l'équipe du Dr A. Carreira et a été publiée récemment (Ehlen et al., Nat Comm 2020). Dans cette étude, la fonction de l'interaction entre BRCA2(167-270) et Plk1 en mitose a été révélée, avec des conséquences importantes sur la stabilité des chromosomes. L'impact de plusieurs variants associés au cancer du sein a été décrit, suggérant ainsi une explication quant à l'aneuploïdie observée dans les tumeurs mutées pour BRCA2. Le projet de thèse prolongera cette première étude, et se concentrera sur (1) les interactions des régions désordonnées et conservées BRCA2(48-218) et BRCA2(1093-1158) avec les phosphatases en mitose (collaboration avec l'équipe du Dr A. Carreira, Institut Curie, Orsay), et (2) les interactions entre BRCA2(2312-2337) et les protéines méiotiques (collaboration avec l'équipe du Prof R. Kanaar, Erasmus Uni Med Center, Rotterdam). Des expériences biophysiques préliminaires ont été réalisées dans l'équipe pour valider ces interactions. Le doctorant caractérisera leurs affinités, les domaines d'interaction minimaux, la régulation par la phosphorylation, la structure 3D à une résolution atomique, en utilisant un ensemble de techniques biophysiques (fluorescence, ITC, spectrométrie de masse) et de biologie structurale (RMN, SAXS, cristallographie à rayons X). Il concevra des mutations perturbant les interactions, qui seront utilisées par nos collaborateurs pour caractériser le rôle fonctionnel de ces interactions dans les cellules. Il/elle testera l'impact des mutations détectées chez les patients atteints de cancer sur ces interactions, et comparera les résultats de ces expériences à ceux obtenus sur les mutations conçues précédemment. À partir de ces analyses, il/elle reconstituera des complexes in vitro comprenant de grands fragments de BRCA2, pour une analyse structurale combinant RMN, cristallographie aux rayons X et cryo-EM.

  • Titre traduit

    Cancer-associated variants in disordered regions of BRCA2: impact in mitosis and meiosis


  • Résumé

    The BReast CAncer susceptibility 2 (BRCA2) protein is essential for DNA repair by homologous recombination (HR) during the S/G2 phases of the cell cycle: it interacts with the recombination proteins RAD51 and DMC1, thus facilitating proper HR in both mitotic and meiotic cells (Jensen et al., 2010; Martinez et al., 2016; Brandsma et al., 2019). In mitosis, it also binds to BUBR1, which is a component of the spindle assembly checkpoint. At the end of mitosis, it localizes to the midbody and facilitates cell division by serving as a scaffold protein for the central spindle components. Several mutations in the gene coding for BRCA2 cause genome instability and are associated with breast and ovarian cancers. Despite the accumulated knowledge about BRCA2 functions, the molecular mechanisms associated to these functions are poorly described. This is in part due to the disordered character of BRCA2, which prevents the identification of well-folded regions with defined targets. Within the 3418 aa of BRCA2, only one single globular domain has been identified, which binds to single-stranded DNA and the small disordered protein DSS1, as observed in the 3D structure of the domain bound to an oligo(dT)9 and DSS1 (Yang et al., 2002). Two small BRCA2 fragments with high predicted disorder propensity have been captured by X-ray crystallography when bound to PALB2 or RAD51 (Oliver et al., 2009; Pellegrini et al., 2002). Through these interactions, BRCA2 coordinates the activities of the recombination factors DSS1 and PALB2 to promote RAD51 loading onto ssDNA and activity during HR. Interactions involving disordered regions remain difficult to identify because the docking sites cannot be accurately predicted using bioinformatics tools. Yet, the lack of well-structured binding sites provides unique functional opportunities for BRCA2 to bind to a large set of partners in a tightly regulated manner. Our team has initiated the structural analysis of the interactions between several disordered and conserved regions of BRCA2 and their partners. The aim is to identify the impact of BRCA2 variants detected in patients with breast and ovarian cancers (listed in the national UMD-BRCA2 database) on these interactions and the associated functional defects. A first interaction with the kinase Plk1 was predicted from an NMR and bioinformatics analysis of BRCA2(167-270), its experimental validation both in vitro and in cells was performed in collaboration with the team of Dr A. Carreira and was recently published (Ehlen et al., Nat Comm 2020). In this study, the function of the interaction between BRCA2(167-270) and Plk1 in mitosis was revealed, with important consequences on chromosome stability. The impact of several variants associated with breast cancer was described, which suggested an explanation for the aneuploidy observed in BRCA2-mutated tumors. The thesis project will extend this first study, and focus on (1) interactions of the disordered and conserved regions BRCA2(48-218) and BRCA2(1093-1158) with phosphatases in mitosis (collab. with the team of Dr A. Carreira, Institut Curie, Orsay), and (2) interactions between BRCA2(2312-2337) and meiotic proteins (collab. with the team of Prof R. Kanaar, Erasmus Uni Med Center, Rotterdam). Preliminary biophysical experiments were performed in the team validating these interactions. The PhD student will characterize their affinities, minimal interacting domains, regulation through phosphorylation, 3D structure at an atomic resolution, by using a panel of biophysical (fluorescence, ITC, mass spectrometry) and structural biology (NMR, SAXS, X-ray crystallography) techniques. He/she will design mutations disrupting the interactions, which will be used by our collaborators to characterize the functional role of these interactions in cells. He/she will test the impact of mutations detected in cancer patients on these interactions, and compared the results of these experiments to those obtained on previously designed mutations. From these analyses, he/she will reconstitute in vitro complexes including large BRCA2 fragments, for structural analysis by a combination of NMR, X-ray crystallography and cryo-EM.