Role et fonction des plateformes de signalisation membranaires contenant la Rho GTPase ROP6 lors de la signalisation cellulaire

par Lucille Gorgues

Projet de thèse en Biologie du développement

Sous la direction de Alexandre Martiniere.

Thèses en préparation à Montpellier , dans le cadre de Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau , en partenariat avec BPMP - Biochimie et Physiologie Moléculaire des Plantes (laboratoire) depuis le 01-11-2020 .


  • Résumé

    Contexte Les plantes, contrairement aux animaux, sont des organismes sessiles qui ne peuvent pas échapper à un environnement hostile. En conséquence, les végétaux possèdent de nombreux mécanismes pour tolérer ces conditions stressantes. Un bon exemple concerne l'adaptation des plantes au manque d'eau. Lors d'une sécheresse, les plantes tendent à réduire leur cycle de vie pour produire leurs graines plus rapidement. Parce qu'elles ont une croissance et un développement continus (Grime et al., 1986), les plantes peuvent aussi modifier leur architecture racinaire et orienter leur croissance de manière à optimiser l'absorption de l'eau (e.g. hydrotropisme,, hydropatterning). En plus de ces changements irréversibles, les plantes sont capables de plasticité fonctionnelle à des échelles de temps très courtes. Dans le cas des feuilles par exemple, elles peuvent ajuster leur transpiration par ouverture ou fermeture des stomates. Similairement, les plantes peuvent, en quelques minutes, réguler la perméabilité à l'eau de leurs racines suivant la quantité d'eau disponible dans le sol (Maurel et al., 2015). En amont de ces adaptations physiologiques, les végétaux doivent être capables de percevoir la disponibilité en eau du milieu. De manière surprenante, les étapes précoces de ces mécanismes de signalisation sont largement inconnues. Alors que le/les mécanismes de perception du signal hydrique reste énigmatiques, les messages secondaires induits en aval sont mieux connues. Par exemple, la production des espèces réactives de l'oxygène (ROS) ont été montrées comme étant nécessaire à l'induction de certaines réponses des plantes au stress osmotique ; c'est particulier le cas de la régulation de la conductivité hydraulique racinaire ou de l'endocytose spécifiques des aquaporines comme PIP2;1 (Boursiac et al., 2005 ; Luu et al., 2012 ; Martiniere et al., 2019). Nous avons au laboratoire identifié les mécanismes moléculaires qui permettent la production de ROS lors d'un signal osmotique. En plus de l'induction de deux isoformes de la NADPH oxidase localisées à la membrane plasmique (RBOHD et RBOHF), des ROS sont également produit par la réaction de Haber Weiss à partir du fer et de l'acrobate apoplastique (Martiniere et al., 2019). Plus récemment, nous avons identifié une protéine clef dans la voie de signalisation osmotique. Il s'agit d'une petite GTPase de la famille des Rho. Cette protéine est capable d'activer les différentes enzymes de production des ROS, en particulier grâce à une interaction avec RBOHD et RBOHF (Smokvarska et al., under review). Lors d'une stimulation osmotique, cette protéine, ROP6, forme dans les membranes des nanodomaines (30-50 nm) dans lesquelles s'accumulent les RBOHs (Smokvarska et al., under review). La formation de ces plateformes de signalisation dans les membranes est nécessaire pour induire la signalisation ROS des cellules (Smokvarska et al., under review). De manière étonnante, nous avons également pu montrer que les nanodomaines de ROP6 sont nécessaire pour l'induction d'autre de type signalisation, en particulier, en réponse à l'hormone auxine (Platre et al., 2019). Des lors, il semble que la protéine ROP6 agit comme un « hub » de la signalisation cellulaire. Mais comment une réponse spécifique peut alors être générée ? Nous émettons l'hypothèse que la nature des constituants des nanodomaines de ROP6 pourrait encoder pour la spécificité du signal. Effectivement, nous avons montré que lors de la signalisation osmotique, RBOHD est recruté dans les nanodomaines de ROP6, mais si les cellules sont stimulées avec de l'auxine ce recrutement n'a pas lieu. Ce projet de thèse tentera de mieux caractériser la nature des nanodomaines de ROP6 afin de déterminer s'ils peuvent être le support de la spécificité de la réponse cellulaire induit lors de différents type de signaux. Objectifs Les objectifs suivants seront développés afin de déterminer le rôle des nanodomaines de ROP6 dans la signalisation cellulaires -Par une approche candidat, il s'agira d'identifier des activateurs directs de ROP6 dans le contexte du signal osmotique mais aussi ABA et PAMPs. La famille des ROPGEF sont des candidats potentiels car ces protéines sont connue pour permettre l'activation des ROPs. Il sera ensuite possible de tester par des approches de génétique et de biologie cellulaire (microscopie confocale et TIRF), leurs interactions avec ROP6. Enfin, par microscopie à super résolution (sptPALM), il sera possible de tester leurs implications dans la formation des nanodomaines de ROP6. -Par une approche d'interactomique, il s'agira d'identifier des protéines constituant des nanodomaines ROP6. Les différents éléments seront ensuite validés et leurs rôles dans la formation ou le maintien des nanodomaines de ROP6 seront testés par génétique inverse. Il sera alors possible d'évaluer leurs implications dans les différents types de signalisation.

  • Titre traduit

    Role and function of ROP6 signaling platform during cell signaling


  • Résumé

    State of the art Unlike animals, plants are sessile organisms which cannot escape from a possibly unsuitable environment. Instead, plants have developed numerous mechanisms to overcome stress conditions. One good example is plant adaptation to water deprivation. Upon drought, plants tend to reduce their life cycle and produce their seeds faster. Moreover, plants undergo postembryonic growth and development, allowing them to adapt their morphology to a changing environment (Grime et al., 1986). For instance, plants can alter their root system architecture or orientate their root growth to optimize water uptake (e.g. hydrotropism). In addition to these irreversible changes, plants are able to adapt over shorter time scales. At the leaf level, they adjust their transpiration rate by opening or closing their stomata. Similarly, plants can modulate the water conductivity of their roots within minutes depending on the soil water content (Maurel et al., 2015). Upstream of all these adaptations to drought, plants must perceive water availability. Strikingly, the early steps of this signaling pathway are as yet unknown. Whereas plant osmotic perception is not really well understood, some secondary messengers acting downstream have been characterized. It is especially the case for reactive oxygen species (ROS) that are induced after application of an osmotic stress. Indeed, ROS accumulation in cells appear to be mandatory for some plant response like the regulation of the root water conductivity and the endocytosis of the aquaporin, PIP2;1 (Boursiac et al., 2005, Luu et al., 2012, Martiniere et al., 2019). In our laboratory, we have characterized the molecular mechanisms that allow ROS production during osmotic signaling. In addition of two plasma membrane NADPH oxidases RBOHD and RBOHF, ROS are also produced from the apoplastic iron and ascorbate by the Haber Weiss reaction (Martiniere et al. 2019). More recently, we have identified a key component of the plant osmotic signaling. It is a small GTPase belonging to the family of Rho protein. This protein is able to activate the different ROS producing enzymes and to interact with RBOHD and F (Smokvarska et al. under review). During osmotic signaling, this protein ROP6, forms nanodomain (30-50 nm) within the plasma membrane. These structures act as signaling platforms that are mandatory to induce ROS production in cells. Strikingly, we have also shows that ROP6 nanodomains are necessary for plant response to other types of signals. It is especially the case for the plant hormone auxin (Platre et al., 2019). Thus, it appears that ROP6 is acting as a Hub protein where several signal are converging. But, how cell can have specific response in this context? We are hypothesizing that the type of protein in the ROP6 nanodomain might encode for signal specificity. Indeed, whereas RBOHD is co-recruited in ROP6 nanodomain in response to osmotic signal, it is not the case after auxin cell stimulation. The PhD project will characterize better the composition of the ROP6 nanodomains and will determine if they can encode for signal specificity. Objectives The PhD project has two main objectives to determine the role of ROP6 nanodomain in cell signaling. -By gene candidate approach, direct ROP6 activators will be characterize for their role in osmotic, ABA and PAMPs signaling. The ROPGEFs family will be study in detail as they are known to be involved in the activation of the ROP proteins. Then, it will be possible by genetic and cell biology approaches (confocal and TIRF microscopy), to determine their interaction with ROP6. With super resolution microscopy, it will be also possible to test their implication in ROP6 nandomain formation. -By generating ROP6 interactom, proteins that are in ROP6 nandomain will be determine. After a validation step, the different protein identified will be tested for their role in ROP6 nandomain formation. Then, it will be possible to determine their implication in different types of signalling events.