Identification des déterminants génétiques du symbiote intestinal Burkholderia insecticola pour la colonisation spécifique du ravageur de légumineuse Riptortus pedestris

par Gaëlle Lextrait

Projet de thèse en Microbiologie

Sous la direction de Peter Mergaert.

Thèses en préparation à université Paris-Saclay , dans le cadre de École doctorale Sciences du Végétal : du gène à l'écosystème , en partenariat avec Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (laboratoire) , Interaction Plantes-Bactéries (equipe de recherche) et de Faculté des sciences d'Orsay (référent) depuis le 30-09-2020 .


  • Résumé

    Contexte: L'insecte phytophage Riptortus pedestris (la punaise du haricot), appartenant aux punaises puantes (Heteroptera, Pentatomomorpha), est un ravageur de légumineuses et en particulier des haricots et du soja. La croissance et le développement de cet insecte dépendent d'une interaction symbiotique avec une bactérie spécifique, Burkholderia insecticola (ou des espèces de Burkholderia étroitement apparentées) (Takeshita et Kikuchi, 2017 ; Ohbayashi et al., 2020). Ces symbiotes bactériens sont logés dans un organe symbiotique spécifique, qui est formé dans la partie postérieure de l'intestin de l'insecte. La punaise des haricots présente une organisation inhabituelle de l'intestin dans laquelle la partie postérieure de l'intestin moyen est physiquement séparée de la partie antérieure (Ohbayashi et al., 2015). Les régions antérieures M1, M2 et M3 de l'intestin moyen sont spécialisées dans la digestion et l'absorption des aliments, et la région postérieure, appelée M4, est spécialisée dans la symbiose. La région M4 de l'intestin moyen porte environ 300 cryptes, organisées en deux rangées en face d'un conduit central et formées par le pliage de la couche de cellules épithéliales. La lumière de ces cryptes abrite une population dense de 10^7 à 10^8 cellules du symbiote B. insecticola. R. pedestris acquiert ses symbiotes de Burkholderia dans le sol environnemental à chaque génération. Les œufs, les jeunes et les nymphes du premier stade sont exempts de symbiotes et parmi les cinq stades de l'insecte, la punaise du haricot acquiert le symbiote Burkholderia en se nourrissant, principalement au stade de développement du deuxième stade. Bien que les sols soient parmi les environnements présentant la plus grande diversité microbienne connue, R. pedestris a une préférence exclusive pour B. insecticola et les espèces apparentées ; seules ces espèces colonisent les cryptes M4. Ainsi, R. pedestris utilise des mécanismes très efficaces pour trier son partenaire spécifique de cette communauté microbienne du sol (Ohbayashi et al., 2020). Nous et nos collaborateurs (équipe Y. Kikuchi, Sapporo Japon) avons identifié trois mécanismes hôtes différents qui contribuent à contrôler la colonisation spécifique des cryptes M4 par B. insecticola. Un organe de tri spécifique, la région resserrée, située à l'entrée de la M4 constitue une porte sélective par laquelle les bactéries ingérées doivent passer pour entrer dans l'organe symbiotique M4 (Ohbayashi et al., 2015). Seules les bactéries possédant les bonnes clés (encore inconnues) peuvent passer la région rétrécie, qui fonctionne donc comme un filtre efficace empêchant la grande majorité des bactéries environnementales de pénétrer dans l'organe symbiotique. En outre, quelques heures après que les bactéries ont traversé la région rétrécie, celle-ci se referme définitivement, empêchant complètement l'entrée de bactéries supplémentaires (Kikuchi et al., 2020). Un dernier mécanisme de spécificité identifié est une sélection par compétition dans le M4. Ce mécanisme permet à B. insecticola ou à des espèces apparentées de concurrencer très efficacement toute bactérie co-infectante telle que des Burkholderia plus lointaines qui ont la capacité de traverser la région restreinte et de coloniser les cryptes mais qui ne sont pas de véritables symbiotes (Itoh et al., 2019). Objectifs : Des facteurs et des fonctions bactériennes impliqués dans l'infection et la colonisation des cryptes de l'organe symbiotique ont également été identifiés. En particulier, nous avons effectué un criblage génétique à l'échelle du génome par Tn-seq qui a révélé tous les gènes bactériens nécessaires à la colonisation de l'organe symbiotique ou du moins la plupart d'entre eux. Néanmoins, les rôles spécifiques de la plupart de ces déterminants de la symbiose de B. insecticola sont encore inconnus. En particulier, nous ne comprenons toujours pas quels gènes et fonctions bactériennes déterminent la spécificité de l'interaction. L'objectif de ce projet de doctorat est d'utiliser la génomique fonctionnelle et la génétique pour apporter des réponses à cette question non résolue, en suivant deux stratégies différentes. 1) Un criblage génétique Tn-seq sera effectué aux tout premiers stades de la colonisation de la crypte M4, lorsque les bactéries ont pénétré dans l'organe symbiotique mais ne se sont pas encore multipliées. 2) Les 130 fonctions symbiotiques de B. insecticola identifiées par Tn-seq, seront testées pour leur contribution à la sélection basée sur la compétition. Ensemble, les résultats de ce projet fourniront des indications sur les déterminants de la spécificité moléculaire bactérienne de la symbiose face aux mécanismes de sélection des symbiotes identifiés déployés par l'hôte. Les résultats feront également apparaître des homologues moléculaires possibles chez l'hôte. Enfin, des indices seront obtenus pour développer des stratégies de lutte biologique contre les insectes nuisibles, basées sur les mécanismes moléculaires de la spécificité des symbiotes. Lot de travail 1 : Les travaux précédents du groupe ont montré que jusqu'à quelques milliers de bactéries peuvent pénétrer dans l'organe symbiotique par la région rétrécie et que cette petite population fondatrice conduit en seulement deux à trois jours - le temps d'infecter complètement l'organe symbiotique - à une population symbiotique de plusieurs dizaines de millions de bactéries (Kikuchi et al., 2020). Notre précédente analyse Tn-seq a été réalisée sur une population symbiotique entièrement établie. Par conséquent, les principaux contributeurs au mécanisme de sélection basé sur la concurrence identifiés seront étudiés plus en détail au moyen d'expériences ad hoc, en fonction de l'identité des gènes.

  • Titre traduit

    Identifying the genetic determinants in the insect gut symbiont Burkholderia insecticola for specific colonization of the legume pest Riptortus pedestris


  • Résumé

    Context: The phytophagous insect Riptortus pedestris (the bean bug), belonging to the stinkbugs (Heteroptera, Pentatomomorpha), is a pest of legume plants and in particular beans and soybeans. The growth and development of this insect depends on a symbiotic interaction with a specific bacterium, Burkholderia insecticola (or closely related Burkholderia species) (Takeshita and Kikuchi, 2017; Ohbayashi et al., 2020). These bacterial symbionts are housed in a specific symbiotic organ, which is formed in the posterior part of the insect gut. The bean bug has an unusual organization of the intestine in which the posterior midgut is physically separated from the anterior part (Ohbayashi et al., 2015). The anterior midgut regions M1, M2 and M3 are specialized for food digestion and absorption, and the posterior region, called M4, is specialized for symbiosis. The M4 midgut region carries about 300 crypts, organized in two rows opposite a central duct and formed by the folding of the epithelial cell layer. The lumen of these crypts harbors a dense population of as many as 107 to 108 cells of the B. insecticola symbiont. R. pedestris acquires its Burkholderia symbionts from the environmental soil every generation. Eggs, hatchlings and first instar nymphs are symbiont free and among the five instar stages of the insect, the bean bug acquires the Burkholderia symbiont by feeding, primarily in the 2nd instar developmental stage. Despite soils being among the environments with the highest known microbial diversity, R. pedestris has an exclusive preference for B. insecticola and related species; only such species are found to colonize the M4 crypts. Thus, R. pedestris uses highly efficient mechanisms to sort their specific partner from this microbial soil community (Ohbayashi et al., 2020). We and our collaborators (Y. Kikuchi team, Sapporo Japan) have identified three different host mechanisms that contribute to control the specific colonization of the M4 crypts with B. insecticola. A specific sorting organ, the constricted region, located at the entrance of the M4 constitutes a selective gate through which ingested bacteria have to pass to enter the M4 symbiotic organ (Ohbayashi et al., 2015). Only those bacteria with the right (still unknown) keys can pass the constricted region, which therefore functions as an effective filter preventing the large majority of environmental bacteria to enter the symbiotic organ. In addition, a few hours after bacteria have passed through the constricted region, it permanently closes, completely preventing the entrance of additional bacteria (Kikuchi et al., 2020). A last identified specificity mechanism is a competition-based selection in the M4. This mechanism allows B. insecticola or allied species to outcompete very efficiently any co-infecting bacteria such as more distantly related Burkholderia that have the capacity to pass the constricted region and colonize the crypts but that are not true symbionts (Itoh et al., 2019). Objectives: Also bacterial factors and functions have been identified that are involved in infection and colonization of the crypts of the symbiotic organ. In particular, we have performed a genome-wide genetic screen by Tn-seq that revealed all or at least most bacterial genes necessary for colonization of the symbiotic organ. Nevertheless, the specific roles for most of these symbiosis determinants of B. insecticola are still unknown. In particular, we still do not understand which bacterial genes and functions determine the specificity of the interaction. The objective of this PhD project is to use functional genomics and genetics to provide answers to this unresolved question, following two different strategies. 1) A Tn-seq genetic screen will be performed at very early stages of M4 crypt colonization, when bacteria have entered the symbiotic organ but have not yet multiplied. 2) All the 130 symbiotic functions of B. insecticola identified by Tn-seq, will be tested for their contribution to the competition-based selection. Together, the results from this project will provide insights in the bacterial molecular specificity determinants of the symbiosis in the face of the identified symbiont selection mechanisms deployed by the host. The results will further hint at possible molecular counterparts in the host. Finally, cues will be obtained to develop strategies for biological control of insect pests, based on the molecular mechanisms of symbiont specificity. Work package 1: Previous work of the group has shown that up to a few thousand bacteria can enter the symbiotic organ through the constricted region and that this small founder population leads in only two to three days - the time to fully infect the symbiotic organ - to a symbiotic population of several tens of millions of bacteria (Kikuchi et al., 2020). Our previous Tn-seq analysis was performed on a fully established symbiotic population. Therefore, the genes identified in this genetic screen could be involved either in the passage through the constricted region or in the multiplication of the founder population to the final symbiotic population. To identify bacterial functions specifically involved in the passage through the constricted region, a Tn-seq screen will be performed at the very early stage of the infection, immediately after passage through the constricted region, but before multiplication of the population. We expect that such a screen will result in the identification of a subset of the genes identified in the previous screen. These genes are potentially specific determinants for the passage through the constricted region. Ad hoc experiments, depending on the nature of the identified genes, will be performed on a number of selected ones in order to further specify their molecular function in the symbiosis. Work package 2: The competition-based selection allows B. insecticola to outcompete any non-symbiotic bacterium that has the capacity to enter the symbiotic organ (Itoh et al., 2019), indicating that B. insecticola has genetic adaptations that confers this fitness advantage within the M4 crypts. The previous Tn-seq screen has identified about 130 genes of B. insecticola involved in symbiosis. For about 50 of them, mutants were generated and for all of them, the symbiotic defect revealed by Tn-seq was confirmed. However, most of these tested mutants were able to colonize seemingly normally the symbiotic organ in single infection experiments but they were systematically outcompeted in the symbiotic organ by the wild type in co-infection experiments. This suggests that the genetic determinants of the competitive advantage of B. insecticola over other bacteria are among these 130 genes identified by Tn-seq. The remaining genes of this collection will be systematically mutagenized and all mutants will be tested for the loss of the competitive advantage in co-infection experiments with non-symbiotic Burkholderia strains that have the capacity to infect the symbiotic organ. The principal contributors to the competition-based selection mechanism identified in this screen will be further studied with ad hoc experiments, depending on the identity of the genes.