Microscopies multiphoton: extension des paramètres observables.

par Júlia Ferrer Ortas

Projet de thèse en Physique

Sous la direction de Emmanuel Beaurepaire et de Willy Supatto.

Thèses en préparation à l'Institut polytechnique de Paris , dans le cadre de École doctorale de l'Institut polytechnique de Paris , en partenariat avec LOB - Laboratoire d'Optique et Biosciences (laboratoire) depuis le 01-12-2017 .


  • Résumé

    L'étude du développement des tissus biologiques complexes, comme par exemple celui du système nerveux, nécessite de mettre au point des méthodes de microscopie permettant d'imager simultanément plusieurs paramètres dans le tissu intact. Un nombre croissant d'études en biologie utilise des marquages multicouleurs reposant sur une combinaison de deux ou trois protéines fluorescentes. Ces approches ont été transposées récemment à l'observation des tissus en les combinant avec des techniques d'imagerie comme la microscopie à deux ou trois photons et la microscopie à feuille de lumière. L'équipe d'accueil est particulièrement active sur ce sujet. L'objectif général du travail de thèse est d'étendre le nombre de paramètres observables en microscopie multiphoton et à nappe de lumière (light sheet). Le travail sera mené dans le cadre de collaborations entre le LOB, l'Institut de la Vision (équipe de Jean Livet), le département de chimie de l'ENS (équipe de Ludovic Jullien), et le LCF IOGS (groupe de Fréderic Druon / laboratoire commun avec la société Amplitude Systèmes). Stratégie développée : Etude de la microscopie non-linéaire multicouleurs en régime d'excitation MHz. Depuis quelques années, des laboratoires académiques et industriels développent une nouvelle génération de sources laser OPA femtoseconde à cadence MHz et émettant dans le proche infrarouge (1-2 µm) . Ce régime d'excitation ouvre des perspectives très nouvelles pour l'imagerie à grande profondeur (microscopie a 3 photons) ou à grande vitesse (microscopie à feuille de lumière à deux photons). L'objectif principal de cette thèse consiste à mettre en œuvre ce type d'excitation pour développer de nouvelles stratégies des tissus en développement reposant sur la microscopie 3-photons multicouleurs. Le travail s'appuie sur une nouvelle génération de source laser récemment installée au laboratoire (collaboration LCF / Amplitude) et fournissant plusieurs sorties à 1030, 1300, 1700 nm. Un des enjeux est de réaliser une imagerie simultanée de 3 voire 4 marqueurs ou signaux. Plusieurs aspects seront étudiés, notamment : identification des combinaisons de protéines fluorescentes excitables ; contrôle du profil spatial et temporel des faisceaux, ainsi que de l'énergie envoyée sur l'échantillon ; excitation par mélange de fréquence à 3 photons ; étude de l'imagerie en profondeur et applications. Dans un deuxième temps et à partir de cette expérience, des expériences d'excitation en régime MHz pourront être envisagées dans le contexte de la microscopie à feuille de lumière biphotonique. Enfin, on pourra envisager la caractérisation des propriétés de fluorophores photocommutables dans ce régime d'excitation.

  • Titre traduit

    Multiphoton microscopy: extension of observable parameters.


  • Résumé

    The study of developing complex biological tissues, like for instance that of the nervous system, requires the development of microscopy methods allowing the simultaneous imaging of several parameters inside the intact tissue. An increasing number of studies in biology use multicolour labels relying on a combination of two or three fluorescent proteins. These approaches have been recently transferred to the observation of tissues combined with imaging techniques like two-photon microscopy and light sheet microscopy. The host team is particularly active in this domain. The general objective of this project is to extend the number of observable parameters in multiphoton and light sheet microscopy. The work will be performed in the frame of collaborations of the LOB with l'Institut de la Vision (team of Jean Livet), the chemistry department of the ENS (team of Ludovic Jullien) and the LCF IOGS (group of Fréderic Druon laboratory in common with Amplitude Systèmes). Main developed strategy: Study of multicolour non-linear microscopy in the MHz excitation regime. Since 1 or 2 years ago, a new OPA laser sources generation, at the MHz repetition rate regime and tunable in the near infrared have become essential. This excitation regime open very new perspectives for deep tissue imaging (3-photon microscopy) and for high speed imaging (two-photon light sheet microscopy). A part of the project will consist on the implementation of this type of excitation for the development of 3-photon multicolour developing tissues microscopy. The work will be based on an innovative source recently installed in the laboratory (collaboration with LCF) which provides several output beams, namely at 1030, 1300 and 1700 nm. One of the objectives is the realisation of simultaneous 4 label imaging. Several aspects will be studied, specifically: identification of the combination of excitable fluorescent proteins ; control of the spatio-temporal profile of the beam and the energy sent to the sample ; wave mixing excitation with 3 photons ; study of deep tissue imaging and its applications. Secondly, and starting from this experiment, two/three-colour excitation experiments at the MHz regime will be considered within the context of biophotonic light sheet microscopy.