Microscopies multiphoton et à feuille de lumière: extension des paramètres observables.

par Júlia Ferrer Ortas

Projet de thèse en Physique

Sous la direction de Emmanuel Beaurepaire et de Willy Supatto.

Thèses en préparation à l'Institut polytechnique de Paris , dans le cadre de École doctorale de l'Institut polytechnique de Paris , en partenariat avec LOB - Laboratoire d'Optique et Biosciences (laboratoire) depuis le 01-12-2017 .


  • Résumé

    L'étude du développement des tissus biologiques complexes, comme par exemple celui du système nerveux, nécessite de mettre au point des méthodes de microscopie permettant d'imager simultanément plusieurs paramètres dans le tissu intact. Un nombre croissant d'études en biologie utilise des marquages multicouleurs reposant sur une combinaison de deux ou trois protéines fluorescentes. Ces approches ont été transposées récemment à l'observation des tissus en les combinant avec des techniques d'imagerie comme la microscopie à deux photons et la microscopie à feuille de lumière. L'équipe d'accueil est particulièrement active sur ce sujet. L'objectif général du travail de thèse est d'étendre le nombre de paramètres observables en microscopie multiphoton et à nappe de lumière (light sheet). Le travail sera mené dans le cadre de collaborations entre le LOB, l'Institut de la Vision (équipe de Jean Livet), le département de chimie de l'ENS (équipe de Ludovic Jullien), et le LCF IOGS (groupe de Fréderic Druon). Deux stratégies complémentaires seront explorées. (A) Adressage sélectif de protéines photo-commutables en microscopie à feuille de lumière grâce à leurs différentes cinétiques de conversion. Cette stratégie, dite OPIOM (Out-of-Phase Imaging after Optical Modulation) a été récemment introduite par l'équipe de L. Jullien à l'ENS. En appliquant une illumination bicolore modulée en intensité, il est possible de distinguer plusieurs protéines photo-commutables ayant des spectres d'absorption/émission similaires mais des cinétiques de commutation distinctes. Cette approche permet d'augmenter le nombre de marqueurs distinguables dans le spectre visible, mais est intrinsèquement assez lente puisqu'elle nécessite d'enregistrer plusieurs images. Un aspect du travail de thèse va donc consister à explorer son implémentation dans un microscope à feuille de lumière, technique d'imagerie parallélisée. L'implémentation se fera dans un premier temps sur un microscope à feuille de lumière monophotonique installé au laboratoire fin 2017. Un développement ultérieur possible concerne l'exploration de la photo-commutation de protéines fluorescentes en excitation multiphotonique. Cette question est encore très exploratoire, car très peu de données sont disponibles sur la photo-commutation de protéines fluorescentes par absorption à deux et trois photons. Un criblage de quelques protéines fluorescentes sera effectué. Selon les résultats, l'implémentation de la méthode ‘OPIOM' sur un microscope à feuille de lumière multiphotonique pourra être envisagé au cours de la 2e année de thèse – en lien avec les développements discutés ci-dessous. (B) Etude de la microscopie non-linéaire multicouleurs en régime d'excitation MHz. Depuis 1 ou 2 ans, une nouvelle génération de sources laser OPA à cadence MHz et accordables dans le proche est devenue disponible. Ce régime d'excitation ouvre des perspectives très nouvelles pour l'imagerie à grande profondeur (microscopie a 3 photons) ou à grande vitesse (microscopie à feuille de lumière à deux photons). Un volet du travail de thèse va consister à mettre en œuvre ce type d'excitation pour développer la microscopie 3-photons multicouleurs de tissus en développement. Le travail s'appuiera sur une source innovante récemment installée au laboratoire (collab LCF) et fournissant plusieurs sorties à 1030, 1300, 1700 nm. Un des enjeux est de réaliser une imagerie simultanée de 4 marqueurs. Plusieurs aspects seront étudiés, notamment : identification des combinaisons de protéines fluorescentes excitables ; contrôle du profil spatial et temporel des faisceaux, ainsi que de l'énergie envoyée sur l'échantillon ; excitation par mélange de fréquence à 3 photons ; étude de l'imagerie en profondeur et applications. Dans un deuxième temps et à partir de cette expérience, des expériences d'excitation bi/tri-colore en régime MHz pourront être envisagées dans le contexte de la microscopie à feuille de lumière biphotonique.

  • Titre traduit

    Multiphoton and light sheet microscopy: extension of observable parameters.


  • Résumé

    The study of developing complex biological tissues, like for instance that of the nervous system, requires the development of microscopy methods allowing the simultaneous imaging of several parameters inside the intact tissue. An increasing number of studies in biology use multicolour labels relying on a combination of two or three fluorescent proteins. These approaches have been recently transferred to the observation of tissues combined with imaging techniques like two-photon microscopy and light sheet microscopy. The host team is particularly active in this domain. The general objective of this project is to extend the number of observable parameters in multiphoton and light sheet microscopy. The work will be performed in the frame of collaborations of the LOB with l'Institut de la Vision (team of Jean Livet), the chemistry department of the ENS (team of Ludovic Jullien) and the LCF IOGS (group of Fréderic Druon). Two complementary strategies will be explored. (A) Selective addressing to photo-commutable proteins in light sheet microscopy thanks to their different conversion kinetics. This strategy, called OPIOM (Out-of-Phase Imaging after Optical Modulation) has been recently introduced by the team of L. Jullien at the ENS. Applying a bicolour intensity-modulated illumination, it is possible to distinguish several photo-commutable proteins which have similar absorption/emission spectra but different commutation kinetics. This approach allows the increase of the number of distinguishable labels within the visible spectrum, but it is intrinsically slow because it requires the recording of several images. An aspect of the work of this project, thus, will consist on exploring its implementation on a light sheet microscope, in-parallel imaging technique. The implementation will be initially performed on a single-photon light sheet microscope installed in the laboratory by the end of 2017. Later on, a possible development concerns the exploration of photo-commutation of fluorescent proteins in multi-photon excitation. This is still a very exploratory question, for very few data are available on photo-commutation of fluorescent proteins. A screening of several fluorescent proteins will be performed. Depending on the results, the implementation of the 'OPIOM' method on a multi-photon light sheet microscope will be considered during the second year of project - in relation to the developments discussed hereunder. (B) Study of multicolour non-linear microscopy in the MHz excitation regime. Since 1 or 2 years ago, a new OPA laser sources generation, at the MHz repetition rate regime and tunable in the near infrared have become essential. This excitation regime open very new perspectives for deep tissue imaging (3-photon microscopy) and for high speed imaging (two-photon light sheet microscopy). A part of the project will consist on the implementation of this type of excitation for the development of 3-photon multicolour developing tissues microscopy. The work will be based on an innovative source recently installed in the laboratory (collaboration with LCF) which provides several output beams, namely at 1030, 1300 and 1700 nm. One of the objectives is the realisation of simultaneous 4 label imaging. Several aspects will be studied, specifically: identification of the combination of excitable fluorescent proteins ; control of the spatio-temporal profile of the beam and the energy sent to the sample ; wave mixing excitation with 3 photons ; study of deep tissue imaging and its applications. Secondly, and starting from this experiment, two/three-colour excitation experiments at the MHz regime will be considered within the context of biophotonic light sheet microscopy.