Etude des étapes d'assemblage du VIH-1 en lien avec le métabolisme du PI(4,5)P2 dans un modèle de macrophages.

par Anne Beziau

Projet de thèse en Sciences de la Vie et de la Santé

Sous la direction de Denys Brand et de Eric Piver.

Thèses en préparation à Tours , dans le cadre de Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant - SSBCV , en partenariat avec Morphogénèse et Antigénicité du VIH et des Virus des Hépatites (laboratoire) depuis le 16-09-2019 .


  • Résumé

    L'assemblage du Virus de l'Immunodéficience Humaine 1 (VIH-1) est initié par la polyprotéine précurseur GAG (Pr55gag) qui se multimérise lors de son adressage à la membrane plasmique. Au cours de ce trafic intracellulaire, Pr55gag est myristoylé et s'ancre au feuillet interne de la membrane plasmique dans des régions enrichies en molécules de phosphatidylinositol4,5- phosphate (PI(4,5)P2). Ce mécanisme rend donc l'assemblage du VIH-1 dépendant de la voie de synthèse des PI(4,5)P2. La production de PI(4,5)P2 est effectuée par une famille de kinases , les phosphatidylinositol4-phosphate 5 kinase de type I (PIP5K1), constituée de 3 isoformes (alpha, beta et gamma). Par une approche de « silencing » de chacune des isoformes nous avons pu mesurer par LC.MS/MS une baisse des PI(4,5)P2 cellulaires (collaboration avec l'U1253). L'inhibition de l'isoforme alpha induit une baisse de 70% des PI(4,5)P2 cellulaires et de prés de 40% lors de l'inhibition des isoformes beta et gamma. Dans un modèle de cellules HeLa nous avons montré par microscopie confocale que seule l'inhibition de l'isoforme alpha ou gamma induit une perte de la localisation membranaire de Pr55gag. L'inhibition de la PIP5K1 alpha relocalise Pr55gag vers les lysosomes alors que l'inhibition de la PIP5K1 gamma réoriente Pr55gag vers les endosomes. Dans les deux cas une baisse de la production de particules virales dans le surnageant est observée. Nous avons donc pu identifier dans des cellules HeLa l'importance des PIP5K1 alpha et gamma pour l'ancrage membranaire de Pr55gag et donc la morphogenèse du VIH-1. Cependant les étude portant sur l'assemblage du VIH-1 dans les macrophages, qui est le second type cellulaire de réplication et potentiel réservoir du VIH-1, mettent en évidence un bourgeonnement viral non plus à la membrane plasmique mais dans des compartiments intracellulaires comme « MultiVesicular Bodies » (MVB). Ces résultats suggèrent une répartition des PI(4,5)P2 au sein des membranes cellulaire des macrophages tout à fait particulière. Le projet de thèse est donc de suivre la localisation de Pr55gag dans des macrophages et d'étudier l'impact de la modulation du métabolisme des PI(4,5)P2 sur l'assemblage et le bourgeonnement du VIH-1.

  • Titre traduit

    Study of HIV-1 assembly steps linked to the PI(4,5)P2 metabolism of in a macrophage model.


  • Résumé

    The assembly of Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) is initiated by the GAG precursor polyprotein (Pr55Gag) which multimerizes during its addressing to the plasma membrane. During this intracellular trafficking, Pr55Gag is myristoylated and anchored to the inner leaflet of the plasma membrane in regions enriched in phsophatidylinositol-4,5-biphosphate molecules (PI(4,5)P2). This mechanism therefore makes the assembly of HIV-1 dependent on the PI(4,5)P2 synthesis pathway. The production of PI(4,5)P2 is carried out by a family of kinases, phsophatidylinositol-4-phosphate kinase type I (PIP5KI), consisting of 3 isoforms (alpha, beta and gamma. By a "silencing" approach of each isoforms, we are able to measure by LC.MS/MS a decrease in cellular PI(4,5)P2 (collaboration with U1253). Inhibition of the alpha isoform induces a 70% decrease in cellular PI(4,5)P2 and nearly 40% in the inhibition of beta and gamma isoforms. In a model of HeLa cells, we have shown by confocal microscopy that only the inhibition of the alpha and gamma isoforms induces a loss of Pr55Gag membrane localization. Upon inhibition of PIP5KIalpha, Pr55Gag is relocated to lysosomes while inhibition of PIP5KIgamma retargeted Pr55Gag to endosomes. In both cases, a decrease in the production of viral particles in the supernatant is observed. We have thus identified in HeLa cells the importance of PIP5K1 alpha and gamma for membrane anchoring of Pr55Gag and thus, the morphogenesis of HIV-1. However, the study of the assembly of HIV-1 in macrophages, which is the second cell type of replication and potential reservoir of HIV-1, reveals a viral budding not in the plasma membrane, but in intracellular compartments such as “MultiVesicular Bodies” (MVB). This suggests a peculiar distribution of PI(4,5)P2 within cell membranes of macrophages. The thesis project is therefor to follow the localization of Pr55Gag in macrophages and to study the impact of the modulation of PI(4,5)P2 metabolism on the assembly and budding of HIV-1.