Caractérisation de l'implication du facteur de transcription EMT dans la résistance du carcinome du sein Luminal B à l'immunothérapie dans des modèles 3D composites microfluidiques.

par Flora Doffe

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Pierre Savagner.

Thèses en préparation à université Paris-Saclay , dans le cadre de École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé , en partenariat avec Immunologie intégrative des tumeurs et immunothérapie des cancers (laboratoire) et de Faculté de médecine (référent) depuis le 01-12-2019 .


  • Résumé

    La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) décrit un processus rapide et souvent réversible au cours duquel les cellules épithéliales relâchent leur cohésion et adoptent un phénotype motile individualisé. L'EMT a été définie à l'origine dans le contexte des stades de développement embryonnaire, dont la morphogenèse cardiaque, la formation du mésoderme et la crête neurale. Les voies associées aux EMT semblent être impliquées dans la progression du cancer, notamment les métastases et la résistance (Klymkowsky et Savagner 2009; Nieto et al. 2016; Savagner 2015). Les facteurs de transcription associés aux EMT (EMTaTF) sont généralement associés à la dissociation, à la motilité, au caractère invasif, à la résistance à l'apoptose et aux propriétés analogues aux cellules souches (Ye et al. 2015). Les EMTaTF appartenant aux familles Snail, Twist et Zeb induisent une résistance à la chimiothérapie et à la radiothérapie dans divers types de cancer, in vitro et in vivo (Sanchez-Tillo et al. 2012; Marcucci, Stassi et De Maria 2016). Plus récemment, le laboratoire hôte et d'autres chercheurs ont montré que les EMTaTF modulaient la réponse immunitaire par divers mécanismes (Terry, Savagner et al. 2017; Terry, Buart et al. 2017; Noman et al. 2017; Chen et al. 2014). Dans le contexte tumoral, les EMTaTF sont généralement exprimés de novo. Ils sont activés par de multiples voies d'activation caractérisant le microenvironnement tumoral précoce (hypoxie, métabolisme glycolytique, activation oncogène, réponse immunitaire, réaction stromale…). Une exception notable parmi EMTaTF est Snail2 / Slug, qui est exprimé physiologiquement dans les cellules épithéliales mammaires normales. Slug est confinée à la couche basale et supporte la différenciation basale par rapport à la luminale, en lien avec le contrôle de la prolifération et de l'apoptose (Nassour et al. 2012). Dans le cancer du sein, l'équilibre entre l'état de différenciation basale / luminale est une caractéristique de la progression tumorale, permettant de distinguer les deux principaux types de tumeurs: tumeurs basales et luminales (en dehors des tumeurs HER2 +) (Cancer Genome Atlas 2012; Guedj et al., 2012). Dans le cancer du sein de type basal, la plupart des cellules expriment des marqueurs basaux (CK5…), pas de récepteurs aux œstrogènes (ER), mais semblent provenir de précurseurs de la lumière (CK8) (Visvader et Stingl, 2014). Dans le cancer du sein Luminal B, la plupart des cellules tumorales expriment des marqueurs luminaux tels que CK8 et ER. Cependant, une sous-population de cellules CK5 + basales est généralement décrite dans les tumeurs B luminales, avec un rôle potentiel dans la progression tumorale (Knox et al. 2014). Nous avons récemment découvert que l'expression de CK5 était fortement corrélée dans le cancer du luminal B avec la P-cadhérine, un marqueur basal et la cible Slug, confirmant l'existence d'une sous-population discrète basale parmi les cellules tumorales lumineuses prédominantes de CK8 (Idoux-Gillet et al. 2018). L'analyse de survie a montré que le niveau d'expression de la P-cadhérine était associé de manière significative à un mauvais pronostic, comme estimé par le taux de survie sans récidive (RFS). Étant donné que Slug est régulé positivement dans les cellules B luminales résistantes au traitement au tamoxifène et est liée à un pronostic moins favorable dans le cancer du sein Luminal B, il est tentant de suggérer que Slug pourrait contrôler les mécanismes de progression et de résistance de Luminal B. Plusieurs éléments suggèrent que cette voie pourrait impliquer une réponse immunitaire: l'activation ou la surexpression de EMTaTF dans des cellules de carcinome du sein se traduit traduit par une réduction de la sensibilité à la lyse médiée par les CTL (Akalay et al. 2013) et par la surexpression de PD-L1, liée à l'immunorésistance. Les cancers du luminal B sont caractérisés par une forte infiltration de cellules NK et de neutrophiles, par rapport aux autres types de cancer du sein (Segovia-Mendoza et Morales-Montor 2019; Makhoul et al. 2018). Les lymphocytes CD4 + et CD8 + sont moins abondants, mais leur présence est associée à un meilleur pronostic. À l'inverse, l'infiltration de macrophages et de Treg est associée à un mauvais pronostic. Clairement, le processus EMT est associé à un remodelage en profondeur de la composition de la membrane des cellules tumorales, exposant de nouvelles protéines de surface telles que la PD-L1, les intégrines et les MMP et en intériorisant ou dégradant d'autres, notamment la E-cadhérine, les marqueurs de jonction et de polarisation (Savagner, 2015). L'objectif de ce projet est d'analyser le rôle et la dynamique de EMTaTF dans ces interactions entre les cellules cancéreuses traitées et les cellules immunitaires dans le microenvironnement local. Objectif Notre objectif est de caractériser l'impact de l'EMTaTF sur la réponse immunitaire au cours de la progression du cancer du sein Luminal B et de la résistance à l'hormono et à la chimiothérapie. Objectifs spécifiques 1) Caractériser le microenvironnement immun de tumeur spécifique au type de cancer du sein Luminal B, y compris le type de différenciation et de prolifération des cellules tumorales, immunitaires et mésenchymateuses, en utilisant des approches de double marquage et d'immunofluorescence. Cette étude se concentrera sur la population élusive de cellules CK5 + dans les échantillons de carcinome du sein LumB et sur les cellules immunitaires du microenvironnement. En outre, nous localiserons les EMTaTF en distinguant les types de cellules distinctes dans l'environnement tumoral. 2) Concevoir un modèle microfluidique 3D Lum B basé sur les résultats de l'objectif 1) Ce modèle combinera une matrice ECM définie, une combinaison de lignées cellulaires épithéliales de carcinomes mammaires et mammaires normaux cultivées sur des microsupports, comprenant des cellules rapporteurs EMT, des adipocytes différenciés et des fibroblastes , en plus des cellules endothéliales dans un environnement microfluidique. Le modèle sera validé en observant le sort des cellules tumorales et la progression des cellules rapporteurs EMT. 3) Surveiller la progression du carcinome du sein Luminal B et la réponse immunitaire après immunothérapie dans ce modèle. Introduire des lymphocytes CTK CD8 +, NK dans le voisinage de la tumeur en utilisant des méthodes microfluidiques. L'accent sera mis sur les méthodes de détection en direct dans les modèles 3D composites microfluidiques à long terme, documentant la prolifération des cellules tumorales, la mort cellulaire, la différenciation et l'organisation, en lien avec la toxicité induite par les cellules immunitaires. Plusieurs voies activant ou inhibant le TEM seront testées dans le système. Des expériences de gain et de perte de fonction ciblant EMTaTF seront également planifiées en collaboration avec d'autres membres du laboratoire.

  • Titre traduit

    Characterization of EMT transcription factor involvement in Luminal B breast carcinoma resistance to immunotherapy in microfluidic composite 3D models.


  • Résumé

    Introduction The epithelial–mesenchymal transition (EMT) describes a rapid and often reversible process during which epithelial cells loosen cohesiveness and adopt an individualized motile phenotype. EMT was originally defined in the context of developmental stages, including heart morphogenesis, mesoderm and neural crest formation. EMT-linked pathways appear to be involved in cancer progression, including metastasis and resistance (Klymkowsky and Savagner 2009; Nieto et al. 2016; Savagner 2015). EMT-associated transcription factors (EMTaTF) are typically associated with inducing cell-cell dissociation, motility, invasiveness, apoptosis resistance and stem cell-like properties (Ye et al. 2015). EMTaTF belonging to the Snail, Twist and Zeb families induce resistance to chemotherapy and radiotherapy in various cancer types, in vitro and in vivo (Sanchez-Tillo et al. 2012; Marcucci, Stassi, and De Maria 2016). More recently, the host lab and others showed that EMTaTF modulate immune response through various mechanisms (Terry, Savagner, et al. 2017; Terry, Buart, et al. 2017; Noman et al. 2017; Chen et al. 2014). In the tumor context, EMTaTF are generally expressed de novo. They are activated through multiple activation pathways characterizing early tumor microenvironment (hypoxia, glycolytic metabolism, oncogenic activation, immune response, stromal reaction…). One notable exception among EMTaTF is Snail2/Slug, which is expressed physiologically in normal mammary epithelial cells. Slug is confined to basal layer and supports basal versus luminal differentiation, in link with proliferation and apoptosis control (Nassour et al. 2012). In breast cancer, the balance between basal/luminal differentiation status is a hallmark of tumor progression, showing a distinct pattern in the two main tumor types: Basal-like and luminal-like tumors (beyond the HER2+ tumors) (Cancer Genome Atlas 2012; Guedj et al. 2012). In basal-like breast cancer, most cells express basal markers (CK5…), do not express Estrogen receptor (ER) but appear to originate from luminal precursors (CK8) (Visvader and Stingl 2014). In Luminal B breast cancer, most tumor cells express luminal markers such as CK8 and ER. However, a subpopulation of basal CK5+ cells is typically described within luminal B tumors, with a potential role in tumor progression (Knox et al. 2014). We found recently that CK5 expression was strongly correlated in Luminal B cancer with P-cadherin, a basal marker and Slug target, supporting the existence of a discrete basal subpopulation among the predominant CK8 luminal tumor cells (Idoux-Gillet et al. 2018). Survival analysis showed that P-cadherin expression level was significantly associated with a poorer outcome, as estimated by the recurrence-free survival (RFS) rate. Considering that Slug is upregulated in luminal B cells surviving tamoxifen treatment and is linked to a poorer outcome in Luminal B breast cancer, it is tempting to suggest that Slug could control Luminal B progression and resistance mechanisms. Several elements suggest that this path could involve immune response: EMTaTF activation or overexpression in breast carcinoma cells was found recently to result in reduced susceptibility to CTL-mediated lysis (Akalay et al. 2013) and in PD-L1 overexpression, linked to immunoresistance. Luminal B carcinoma are characterized by a strong infiltration of NK cells and neutrophils, as compared to other breast carcinoma types (Segovia-Mendoza and Morales-Montor 2019; Makhoul et al. 2018). CD4+ and CD8+ lymphocytes are less abundant, but their presence is associated to a better prognosis. Conversely, macrophages and Tregs infiltration is associated with poor prognosis. Clearly, EMT process is associated with a deep remodeling of tumor cell membrane composition, exposing new surface proteins such as PD-L1, integrins and MMPs and internalizing or degrading others, including E-cadherin, junctional and polarization markers (Savagner, 2015). Analyzing the role and dynamics of EMTaTF in these interactions between treated cancer cells and immune cells in the local microenvironment is the goal of this project. Objective Our goal is to characterize EMTaTF impact on immune response during Luminal B breast cancer progression and resistance to hormono and chemotherapy. Specific aims 1) Characterize Luminal B breast carcinoma type-specific tumor immune microenvironment including tumor, immune, and mesenchymal cell differentiation and proliferation pattern using double-labeling and immunofluorescence approaches. This study will focus on the elusive CK5+ cell population in LumB breast carcinoma samples and on the immune cells from the microenvironment. In addition, we will monitor EMTaTF expression pattern by distinct cell types in tumor environment. 2) Design a 3D Lum B microfluidic model based on results from objective 1) This model will combine a defined ECM matrix, a combination of normal mammary and breast carcinoma epithelial cell line grown on microsupports, including EMT-reporter cells, differentiated adipocytes and fibroblasts, in addition to endothelial cells in a microfluidic environment. Validate the model by monitoring tumor cell fate and EMT-reporter cell progression. 3) Monitor Luminal B breast carcinoma progression and immune response following immunotherapy in this model. Introduce CTL CD8+, NK lymphocytes in the tumor organoid vicinity using microfluidic methods. Focus on live detection methods in long-term composite microfluidic 3D models, documenting tumor cell proliferation, cell death, differentiation and organization, in link with immune cell-induced toxicicity. Several pathways activating or inhibiting EMT will be tested in the system. Gain and loss of function experiments targeting EMTaTF will also be planned in collaboration with other members from the laboratory.