Positionnement nucléaire et SUMOylation dans le maintien de l'intégrité des fourches de réplication

SUMO-dependent nuclear positioning safeguards replication fork integrity and competence

• Auteur / Autrice : Kamila Schirmeisen
• Direction : Sarah Lambert
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 14/12/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Intégrité du génome, ARN et cancer (2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Manuel Mendoza
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marie-Noëlle Simon, Gérard Mazón, Catherine Freudenreich
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Manuel Mendoza, Marie-Noëlle Simon

Mots clés

Mots clés contrôlés

ADN -- Réparation

Sumoylation

Chromatine

Recombinaison homologue

ADN -- Réplication

Mots clés libres

Réplication

Recombinaison homologue

Mobilité de la chromatine

SUMOylation

Réparation de l'ADN

Replication

Homologous recombination

Chromatin mobility

SUMOylation

DNA repair

Résumé

La transmission fidèle du patrimoine génétique est un processus cellulaire essentiel à la vie. Des accidents survenant au cours de la réplication, nommés stress de réplication, sont une source majeure d'instabilité génétique alimentant la tumorigenèse. La prise en charge du stress réplicatif survient dans un noyau présentant des compartiments avec des capacités de réparation différentes. Chez les eucaryotes, certains dommages de l'ADN présentent une mobilité accrue, un phénomène qui leur permet de changer de compartiment nucléaire afin de terminer le processus de réparation. De même, des fourches de réplication, dont la progression est altérée, se déplacent vers la périphérie pour s'ancrer aux complexes du pore nucléaire (CPN). Ces changements de compartiments sont régulés par le métabolisme de petits modificateurs de type ubiquitine (SUMO), qui jouent un rôle essentiel pour réguler spatialement les activités de la voie de réparation par la recombinaison homologue (RH). Nous avons précédemment établi, chez la levure Schizossacharomyces pombe, qu'une fourche de réplication bloquée par une protéine liée à l'ADN se relocalise et s'ancre au CPN de manière SUMO-dépendante. La formation de chaînes SUMO déclenche la relocalisation mais limite l'efficacité de redémarrage de la réplication par la RH. Un routage vers le CPN permet aux intermédiaires conjugués SUMO d'être éliminés par la protéase Ulp1 et le protéasome, dont les activités sont enrichies à la périphérie nucléaire. Mon projet de thèse vise à décrypter comment le métabolisme SUMO et le CPN contribuent à la protection des fourches et à leur redémarrage. Pour cela, j'ai utilisé une approche de biologie synthétique pour bloquer la progression d'une seule fourche de réplication et étudier son devenir dans l'espace nucléaire de S. pombe. Tout d'abord, j'ai caractérisé le rôle du panier nucléaire, un sous-complexe du CPN, dans la réactivation des fourches par la RH. J'ai découvert que la nucléoporine Nup60 assure la stabilité et la séquestration de la protéase SUMO Ulp1 à la périphérie nucléaire. J'ai aussi révélé que la nucléoporine Alm1 est importante pour la relocalisation et/ou l'ancrage des fourches bloquées au CPN. L'analyse de ces nucléoporines m'a permis de démêler les fonctions distinctes de Ulp1 et du protéasome dans la dynamique de redémarrage des fourches par la RH. J'ai montré, par une approche génomique cartographiant l'utilisation des ADN polymérases (Pu-seq), que les CPN associés à Ulp1 agissent sur la reprise de la synthèse d'ADN au niveau des fourches bloquées, tandis que les CPN associés au protéasome maintiennent la vitesse des fourches redémarrées. Les activités d'Ulp1 et du protéasome ne sont pas interchangeables et affectent différemment la dynamique du redémarrage des fourches par la RH. De plus, j'ai caractérisé la vague de SUMOylation qui se produit au site d'arrêt des fourches : la monoSUMOylation est insuffisante pour relocaliser les fourches à la périphérie nucléaire mais suffisante pour assurer la protection des fourches dans le nucléoplasme. En étudiant les rôles des deux SUMO ligases connues chez S. pombe, j'ai montré que, contrairement à Pli1, Nse2 n'est nécessaire ni pour la protection des fourches ni pour leur relocalisation à la périphérie nucléaire. Enfin, j'ai découvert que le compartiment nucléoplasmique est moins efficace dans la protection des fourches lorsque Ulp1 n'est pas séquestré à la périphérie nucléaire, alors que cette dernière fournit un environnement "protecteur des fourches" par des mécanismes encore inconnus. L'ensemble de mes résultats suggèrent que la répartition spatiale du métabolisme SUMO et le positionnement nucléaire des sites de stress de réplication sont des déterminants clés de l'intégrité et du redémarrage des fourches de réplication. Ce travail permet de comprendre comment l'altération du métabolisme SUMO, fréquemment observée dans diverses maladies comme le cancer, influence le maintien de l'intégrité du génome.

The maintenance of genome stability is crucial to ensuring the high-fidelity transmission of genetic information. Flaws in the DNA replication process, known as replication stress, has emerged as a major source of genome instability that fuels cancer development. Resolving replication stress occurs within a compartmentalized nucleus that exhibits distinct DNA repair capacities. In different eukaryotic organisms, DNA damage sites exhibit increased chromatin mobility, a phenomena that allow DNA damages to shift away from their nuclear compartment to achieve DNA repair. Similarly, replication forks whose progression is altered, were previously shown to shift to the nuclear periphery for anchorage to nuclear pore complexes (NPCs). These changes in nuclear positioning is regulated by small ubiquitin-like modifier (SUMO) metabolism, which is pivotal to spatially segregate the activities of the homologous recombination (HR) pathway. Our previous work in the fission yeast Schizossacharomyces pombe, has established that a replication fork blocked by a DNA-bound protein relocates and anchors to NPC in a SUMO-dependent manner. SUMO chains trigger the relocation of but also limit the efficiency of replication restart by HR. These SUMO conjugates can be cleared off by the SENP protease Ulp1 and the proteasome, whose activities are enriched at the nuclear periphery. Thus, a routing towards NPCs allows HR-dependent replication restart by counteracting the toxicity of SUMO chains. My thesis project aims at deciphering how the spatial segregation of SUMO metabolism, together with NPCs, safeguard the integrity of replication fork and their replication competence. To reach this objective, I have exploited a synthetic biology approach to block the progression of a single replication fork and to investigate its fate within the nuclear space of the yeast S. pombe. First, I characterized the role of the nuclear basket, a sub-complex of the NPC, in facilitating recombination-dependent replication restart. I discovered that the nucleoporin Nup60 ensures the stability and the sequestration of the SUMO protease Ulp1 at the nuclear periphery. Also, I revealed that the nucleoporin Alm1 is important for the efficient relocation and/or anchorage of arrested forks. The analysis of these two nucleoporins allowed me to disentangle the distinct functions of the SUMO protease Ulp1 and the proteasome in the dynamics of fork restart by HR. Using a genomic approach to map the usage of DNA polymerases (Pu-seq), I revealed that Ulp1-associated NPCs ensure an efficient initiation of DNA synthesis at restarted forks whereas proteasome-associated NPCs sustain the speed of restarted forks. The activities of Ulp1 and the proteasome cannot compensate each other but rather affect differently the dynamics of HR-dependent fork restart. Moreover, I have better characterized the wave of SUMOylation that occurs at site of fork arrest. While monoSUMOylation is insufficient to trigger the relocation towards the nuclear periphery, it is sufficient to safeguard fork integrity in the nucleoplasm. By investigating the division of labour of the two known SUMO ligases in fission yeast, I found that unlike Pli1, Nse2-dependent SUMOylation is dispensable for both relocation and protection of arrested forks. Finally, I found that the lack of Ulp1 sequestration at the nuclear periphery makes the nucleoplasmic compartment less efficient at ensuring fork protection, whereas the nuclear periphery provides a better “fork protective” environment by mechanisms that remain unknown. Taken together, my results suggest that a spatially segregated SUMO metabolism and the nuclear positioning of replication stress sites are key determinants of replication forks integrity and restart. This thus shed light on how the distortion of SUMO equilibrium, frequently reported in a variety of human diseases including cancer, influences the maintenance of genome integrity at replication stress sites.