Photobiomodulation en dermatologie : caractérisation des propriétés anti-inflammatoires & rôle de Nrf2

par Sara Salman (Melhem)

Projet de thèse en Toxicologie

Sous la direction de Saadia Kerdine-rÖmer.

Thèses en préparation à université Paris-Saclay , dans le cadre de École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Inflammation, Microbiome, Immunosurveillance (laboratoire) et de Faculté de pharmacie (référent) depuis le 12-11-2019 .


  • Résumé

    La peau, l'organe le plus étendu de l'organisme, est dotée de multiples fonctions assurant le maintien de l'homéostasie du milieu intérieur, telles que la fonction thermorégulatrice, sécrétoire, métabolique, sensorielle et surtout protectrice. Ainsi, la peau constitue la première barrière physique qui protège les organes internes des agressions environnementales (chimiques, biologiques ou physiques). Par ailleurs, la peau est un organe immunitaire (McLafferty et al., 2012 ; Bos, 1997). Sur le plan structural, ce tissu est formé de trois couches tissulaires superposées : la plus externe étant l'épiderme, en dessous une couche plus épaisse, le derme et la couche la plus profonde de tissu adipeux formant l'hypoderme. L'épiderme est un épithélium de revêtement formé essentiellement de kératinocytes (KCs) (90% des cellules). Sa fonction principale est la protection de l'organisme contre les agressions extérieures. Au-delà de former la barrière physique primaire, les KC contribuent également activement à la barrière immunologique de la peau et jouent un rôle central dans l'immunité innée ainsi que dans le développement des réactions inflammatoires (Clausen and Stoitzner, 2015). On retrouve également dans l'épiderme, les mélanocytes et les cellules de Langerhans (LCs). Les premiers interviennent dans la pigmentation de la peau et participent à sa protection contre les rayons UV grâce à la synthèse de la mélanine, alors que les LCs sont des cellules immunitaires présentant de longues dendrites qui leur permettent de capturer les corps étrangers ayant franchi la barrière cutanée, et donc participent à l'initiation de la réponse immunitaire (Mélissopoulos and Levacher, 2012). L'épiderme est un épithélium stratifié, pavimenteux puisqu'il est organisé en cinq strates cellulaires superposées, dont la plus superficielle est la couche cornée. Tous les KCs sont produits à partir d'une couche unique de cellules basales, dont 15% sont constamment en mitose. Le reste des cellules quiescentes interviennent quand une augmentation de la prolifération est requise, par exemple en cas de blessure (Blanpain and Fuchs, 2006). A la surface, les KCs deviennent plats, anucléés (cornéocytes) formant la couche cornée, compacte en profondeur et desquamante en superficie. La peau doit sa grande résistance aux propriétés physicochimiques de sa couche cornée, où les cornéocytes sont gorgés de kératines alignées en réseau étanche grâce à la filaggrine (Fernandez-Flores, 2015 ; McLafferty et al., 2012). Cette protéine est le témoin de la différenciation cellulaire qui joue un rôle important dans l'intégrité de la barrière cutanée (Levin et al., 2013). Par ailleurs, les KCs libèrent des lipides hydrophobes comme les céramides qui préviennent le dessèchement cutané. Le calcium joue le rôle régulateur dans la synthèse des protéines de l'épiderme, ainsi que pour les adhésions intercellulaires et la différenciation épidermique (Bikle, 2012). Quant au derme, c'est un tissu conjonctif de soutien, vivace et dynamique, majoritairement constitué de fibroblastes qui synthétisent des fibres de collagène et d'élastine. Ces protéines confèrent à la peau sa résistance aux attaques surtout physiques. On y retrouve aussi des cellules immunitaires telles que les cellules dendritiques (DCs) et les macrophages, des acteurs cruciaux de l'immunité cutanée. Un tissu lymphoïde est associé à la peau (« SALT », skin associated lymphoid tissue) (Streilein, 1983), il est appelé aujourd'hui « système immunitaire de la peau » (« SIS », skin immune system). Certaines cellules résidentes de la peau sont décrites comme sentinelles de l'immunité (Nestle et al., 2009 ; Richmond and Harris, 2014). Les KCs sont impliqués dans la détection des pathogènes et des signaux de danger, les DCs et les macrophages sont capables d'initier un éventail de réponses immunitaires. Les fibroblastes contribuent à la réponse inflammatoire locale et les LTs effectuent des fonctions effectrices cruciales. L'inflammation cutanée: L'inflammation correspond à l'ensemble de réactions immunitaires, généralement bénéfiques, générées par l'organisme en réponse à une agression telle qu'une infection ou une lésion physique. Cliniquement, elle se manifeste par les 4 symptômes caractéristiques : la chaleur, la douleur, la rougeur et l'œdème. La réponse inflammatoire a pour but d'inactiver ou de détruire les éléments étrangers, d'éliminer les débris cellulaires et de préparer le terrain pour permettre la réparation des tissus endommagés (Weiss, 2008). Selon Dainichi et collaborateurs (2014), les pathologies inflammatoires chroniques de la peau (allergie cutanée, dermatite atopique, psoriasis) sont induites suite à un dysfonctionnement dans l'un des trois niveaux de défense de la peau : la fonction barrière, l'immunité innée ou l'immunité adaptative. Dans la peau saine, tous les types cellulaires produisent des espèces réactives de l'oxygène (ERO) (Korkina and Pastore, 2009). Les mélanocytes et les KCs produisent du peroxyde d'hydrogène et des radicaux superoxydes par la réaction de la phéomélanine et des UVs (Pelle et al., 2005). Les fibroblastes et les autres cellules produisent de larges quantités d'anions superoxydes en tant que produit dérivé du transfert d'électron dans la chaîne respiratoire mitochondriale (Bazso-Dombi et al., 2000). Si un déséquilibre survient entre les systèmes oxydants et les capacités anti-oxydantes d'un organisme, d'une cellule ou d'un compartiment cellulaire, on parle alors de stress oxydant (Barouki, 2006). Mécanisme anti-inflammatoire induit par Nrf2: Le facteur de transcription Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) est un indicateur de stress oxydant pour la cellule. Il s'agit d'un membre de la famille cap'n'collar, basic leucine zipper, qui inclut également p45NF-E2, Nrf1, Nrf3, BACH1 et BACH2 (Sykiotis and Bohmann, 2010). Nrf2 forme un dimère avec l'une des petites protéines Maf et se lie à des séquences antioxydantes ou électrophiles localisées dans les régions promotrices de gènes codant pour des protéines de défense cellulaire. Ces séquences sont appelées Antioxidant Response Element (ARE) et plusieurs centaines de gènes comprenant cette séquence promotrice ont été identifiés (Suzuki and Yamamoto, 2015). Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap 1) est le répresseur cytosolique de Nrf2, il interagit avec l'un de ses domaines correspondant à un signal de sa dégradation, appelé Nrf2-ECH homology domain 2. Keap 1 intéragit également avec la protéine Cullin 3 (Cul3) pour former un complexe ubiquitin E3 ligase qui entraîne l'ubiquitination de Nrf2 presqu'exclusivement (Suzuki and Yamamoto, 2017). Les résidus lysine qui résident entre les deux motifs sont la cible de l'ubiquitination. En condition basale, il est lié à Nrf2 dans le cytoplasme et entraîne son ubiquitination et sa dégradation par le protéasome 26S. Nrf2 est ubiquitaire, avec une présence accrue dans les KCs (Schäfer et al., 2012). Un gradient de l'expression de Nrf2 et de son activité a été décrit dans des cellules Normal Human Epidermal Keratinocytes (NHEK) ayant subi une différenciation par prolongation de leur culture après confluence (Piao et al., 2011). L'expression de NQO-1, est induite à un stade tardif de différenciation des NHEK (7 jours après la confluence des cellules), tandis que Nrf2 a été activé quelques jours avant (au bout de 3 jours). Les cellules des couches supérieures expriment davantage Nrf2 et ses gènes cibles que les cellules basales non différenciées. Le gradient de Nrf2 coïncide avec l'apoptose préférentielle des KCs des couches supérieures, en réponse à l'environnement et particulièrement aux irradiations UVs. La présence de Nrf2 est importante pour l'élimination des cellules endommagées ou mutées et la protection des KCs des couches supérieures de l'épiderme est cruciale pour l'intégrité de la peau (Schäfer and Werner, 2015). La lumière en dermatologie: L'utilisation de la lumière pour le traitement de la peau remonte au début du XXème siècle avec le prix Nobel de médecine 1903 de NR Finsen pour sa contribution au traitement du lupus vulgaris par de la concentration d'ondes lumineuses. Le manque d'explication des mécanismes impliqués dans ces traitements a plongé la photothérapie dans l'oubli jusqu'à l'avènement des lasers, il y a une quarantaine d'année. Contrairement à l'utilisation classique des lasers, basée sur des mécanismes de destruction et réparation, l'utilisation d'un laser He-Ne (632 nm) de faible intensité a montré un effet de stimulation cellulaire notamment par l'observation d'une stimulation de la migration et la prolifération cellulaire (Whelan et al., 2001). Ces travaux préliminaires ont été soutenus par les travaux de T. Karu qui a proposé une explication des effets de la lumière par une activation de la chaine respiratoire (Karu, 1999). Ces premières preuves de mécanismes cellulaires ont donné naissance à la discipline baptisée Low Level Light Therapy ou encore photobiomodulation. Les avancées technologiques effectuées sur les LEDs de longueurs d'onde visible à proche infra-rouge, ont permis de renforcer l'essor de la photobiomodulation dans le domaine de la dermatologie. Depuis une quinzaine d'années, les travaux de D. Barolet et D. McDaniel ont démontré l'efficacité de ces traitements par la lumière visible et infra-rouge dans des processus anti-âge et anti-inflammatoire. Ils ont notamment démontré in vitro une stimulation de synthèse de nouvelles protéines (collagène, élastine, …) par les fibroblastes (Barolet et al., 2010, McDaniel et al., 2010). Ces travaux ont été confirmés en clinique avec des effets impressionnants sur la régénération tissulaire pour le traitement des rides, des cicatrices et des ulcères pour la lumière rouge et infra-rouge ; les rosacées et les vergetures pour la lumière verte ; enfin sur l'acné et le psoriasis pour la lumière bleue. Problématique scientifique Notre peau est constamment exposée à des conditions environnementales pro-inflammatoires (UV, pollution, cosmétiques, alimentation). L'aggravation de ces facteurs tend à une augmentation des affections de la peau d'origine pro-inflammatoire allant de la couperose jusqu'à l'érythrose. Ces affections sont souvent associées à une hypersensibilité cutanée avec des peaux très réactives qui ne supportent aucun traitement. Cette hypersensibilité toucherait 59 % de la population (+ 7 % en 10 ans selon Etude Observationnelle Bioderma, 2017) avec une croissance accrue aux Etats-Unis (+ 35% en 14 ans). Les travaux fondateurs d'InDerm ont démontré l'intérêt de combiner d'une part, différentes longueurs d'onde entre elles et d'autre part, de coupler la photobiomodulation à une stimulation chimique par des actifs de grade cosmétique. Ces travaux ont notamment démontré la synergie de ces différents modes d'induction tissulaire. Cependant, les mécanismes sous-jacents justifiant la combinaison de la lumière aux actifs de grade cosmétique dans l'amélioration de la réponse inflammatoire ne sont pas étudiés ni explicités. C'est pourquoi, notre principal objectif est de comprendre les mécanismes par lesquels l'irradiation par la lumière visible et proche infra-rouge à faible consommation d'énergie (Photobiomodulation, 400 – 1000 nm) associée à des principes actifs, contribue à un effet anti-inflammatoire cutané. Sachant que le facteur de transcription Nrf2 a été démontré comme régulant la réponse inflammatoire et particulièrement la réponse inflammatoire cutanée, nous adresserons le rôle de Nrf2 dans l'effet anti-inflammatoire de la photobiomodulation. Ce projet de thèse associe l'expertise de l'industriel autour des effets de combinaisons lumière/actifs sur la peau avec celle du laboratoire académique sur les mécanismes cellulaires associés à la voie Nrf2.

  • Titre traduit

    Photobiomodulation in dermatology: characterization of anti-inflammatory properties & role of Nrf2


  • Résumé

    The skin, the most extensive organ of the body, is endowed with multiple functions ensuring the maintenance of homeostasis of the internal environment, such as thermoregulatory, secretory, metabolic, sensory and especially protective functions. Thus, the skin is the first physical barrier that protects the internal organs from environmental aggressions (chemical, biological or physical). In addition, the skin is an immune organ (McLafferty et al., 2012; Bos, 1997). Structurally, this tissue consists of three superposed tissue layers: the outermost layer being the epidermis, below a thicker layer, the dermis and the deepest layer of adipose tissue forming the hypodermis. The epidermis is a coating epithelium composed essentially of keratinocytes (KCs) (90% of cells). Its main function is to protect the body against external aggressions. In addition to forming the primary physical barrier, KCs also actively contribute to the skin's immunological barrier and play a central role in innate immunity and the development of inflammatory reactions (Clausen and Stoitzner, 2015). Melanocytes and Langerhans cells (LCs) are also found in the epidermis. The former are involved in the pigmentation of the skin and participate in its protection against UV rays through the synthesis of melanin, while LCs are immune cells with long dendrites that allow them to capture foreign bodies that have crossed the skin barrier, and thus participate in the initiation of the immune response (Mélissopoulos and Levacher, 2012). The epidermis is a stratified, squamous epithelium since it is organized into five superposed cellular layers, the most superficial of which is the stratum corneum. All KCs are produced from a single layer of basal cells, 15% of which are constantly in mitosis. The remaining quiescent cells are involved when increased proliferation is required, for example, in the event of injury (Blanpain and Fuchs, 2006). On the surface, the KCs become flat, anucleated (corneocytes) forming the stratum corneum, compact in depth and desquamating in surface. The skin owes its high resistance to the physicochemical properties of its stratum corneum, where corneocytes are filled with keratins aligned in a waterproof network using filaggrin (Fernandez-Flores, 2015; McLafferty et al., 2012). This protein is the control of cell differentiation that plays an important role in the integrity of the skin barrier (Levin et al., 2013). In addition, KCs release hydrophobic lipids such as ceramides that prevent skin dryness. Calcium plays the regulatory role in the synthesis of epidermal proteins, as well as for intercellular adhesions and epidermal differentiation (Bikle, 2012). As for the dermis, it is a connective tissue of support, perennial and dynamic, mainly composed of fibroblasts that synthesize collagen and elastin fibers. These proteins give the skin its resistance to attacks, especially physical ones. There are also immune cells such as dendritic cells (DCs) and macrophages, crucial actors in skin immunity. A lmphoid tissue is associated with the skin ('SALT', skin associated lymphoid tissue) (Streilein, 1983), it is now called the 'skin immune system' ('SIS'). Some resident skin cells are described as immunity sentinels (Nestle et al., 2009; Richmond and Harris, 2014). KCs are involved in the detection of pathogens and danger signals, DCs and macrophages are able to initiate a range of immune responses. Fibroblasts contribute to the local inflammatory response and LTs perform crucial effective functions. Skin inflammation Inflammation is the set of immune reactions, generally beneficial, generated by the body in response to an attack such as an infection or physical injury. Clinically, it is manifested by the 4 characteristic symptoms: heat, pain, redness and edema. The inflammatory response aims to inactivate or destroy foreign elements, remove cellular debris and prepare the ground for the repair of damaged tissues (Weiss, 2008). According to Dainichi and colleagues (2014), chronic inflammatory skin diseases (skin allergy, atopic dermatitis, psoriasis) are induced following a dysfunction in one of the three levels of skin's defence: barrier function, innate immunity or adaptive immunity. In healthy skin, all cell types produce reactive oxygen species (ROS) (Korkina and Pastore, 2009). Melanocytes and KCs produce hydrogen peroxide and superoxide radicals through the reaction of pheomelanin and UVs (Pelle et al., 2005). Fibroblasts and other cells produce large amounts of superoxide anions as a by-product of electron transfer in the mitochondrial respiratory chain (Bazso-Dombi et al., 2000). If an imbalance occurs between oxidizing systems and the antioxidant capacities of an organism, cell or cell compartment, this is called oxidative stress (Barouki, 2006). Anti-inflammatory mechanism induced by Nrf2 The transcription factor Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) is an oxidative stress indicator for the cell. It is a member of the cap'n'collar family, basic leucine zipper, which also includes p45NF-E2, Nrf1, Nrf3, BACH1 and BACH2 (Sykiotis and Bohmann, 2010). Nrf2 forms a dimer with one of the small Maf proteins and binds to antioxidant or electrophilic sequences located in regions promoting genes encoding cell defence proteins. These sequences are called Antioxidant Response Element (ARE) and several hundred genes comprising this promoter sequence have been identified (Suzuki and Yamamoto, 2015). Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap 1) is the cytosolic repressor of Nrf2, it interacts with one of its domains corresponding to a signal of its degradation, called Nrf2-ECH homology domain 2. Keap 1 also interacts with the Cullin 3 protein (Cul3) to form an E3 ubiquitin ligase complex that results in the ubiquitination of Nrf2 almost exclusively (Suzuki and Yamamoto, 2017). Lysine residues that reside between the two units are the target of ubiquitination. In basal condition, it is bound to Nrf2 in the cytoplasm and causes its ubiquitination and degradation by the proteasome 26S. Nrf2 is ubiquitous, with an increased presence in KCs (Schäfer et al., 2012). A gradient of Nrf2 expression and activity has been described in Normal Human Epidermal Keratinocytes (NHEK) cells that have undergone differentiation by extending their culture after confluence (Piao et al., 2011). The expression of NQO-1 is induced at a late stage of NHEK differentiation (7 days after cell confluence), while Nrf2 was activated a few days before (after 3 days). Upper layer cells express Nrf2 and its target genes more than undifferentiated basal cells. The gradient of Nrf2 coincides with the preferential apoptosis of the KCs of the upper layers, in response to the environment and particularly to UV radiation. The presence of Nrf2 is important for the elimination of damaged or mutated cells and the protection of KCs from the upper layers of the epidermis is crucial for skin integrity (Schäfer and Werner, 2015). Light in dermatology The use of light for skin treatment dates back to the early 20th century with NR Finsen's 1903 Nobel Prize for Medicine for its contribution to the treatment of lupus vulgaris through the concentration of light waves. The lack of explanation of the mechanisms involved in these treatments led phototherapy to be forgotten until the advent of lasers some 40 years ago. Unlike the traditional use of lasers, based on destruction and repair mechanisms, the use of a low-intensity He-Ne laser (632 nm) has shown a cellular stimulation effect, in particular by observing a stimulation of migration and cellular proliferation (Whelan et al., 2001). This preliminary work was supported by the work of T. Karu, who proposed an explanation of the effects of light by activating the respiratory chain (Karu, 1999). These first proofs of cellular mechanisms gave birth to the discipline called Low Level Light Therapy or photobiomodulation. Technological advances in near-infrared visible wavelength LEDs have made it possible to strengthen the development of photobiomodulation in the field of dermatology. Over the past fifteen years, the work of D. Barolet and D. McDaniel has demonstrated the effectiveness of these treatments with visible and infrared light in anti-aging and anti-inflammatory processes. In particular, they have demonstrated in vitro stimulation of the synthesis of new proteins (collagen, elastin, etc.) by fibroblasts (Barolet et al., 2010, McDaniel et al., 2010). These studies have been clinically confirmed with impressive effects on tissue regeneration for the treatment of wrinkles, scars and ulcers for red and infrared light; rosacea and stretch marks for green light; and acne and psoriasis for blue light. Scientific issues: Our skin is constantly exposed to pro-inflammatory environmental conditions (UV rays, pollution, cosmetics, food). The aggravation of these factors tends to increase skin disorders of pro-inflammatory origin ranging from rosacea to erythrosis. These conditions are often associated with skin hypersensitivity with highly reactive skin that cannot tolerate any treatment. This hypersensitivity would affect 59% of the population (+7% in 10 years according to the Bioderma Observational Study, 2017) with increased growth in the United States (+35% in 14 years). InDerm's founding work has demonstrated the value of combining different wavelengths with each other and coupling photobiomodulation with chemical stimulation by cosmetic grade active ingredients. This work has demonstrated the synergy of these different modes of tissue induction. However, the underlying mechanisms justifying the combination of light with cosmetic grade active ingredients in improving the inflammatory response are not studied or explained. This is why our main objective is to understand the mechanisms by which irradiation by visible and near infrared light with low energy consumption (Photobiomodulation, 400 - 1000 nm) combined with active ingredients, contributes to an anti-inflammatory effect on the skin. Knowing that the transcription factor Nrf2 has been demonstrated to regulate the inflammatory response and particularly the cutaneous inflammatory response, we will address the role of Nrf2 in the anti-inflammatory effect of photobiomodulation. This thesis project combines the industrial company's expertise in the effects of light/active combinations on the skin with that of the academic laboratory on the cellular mechanisms associated with the Nrf2 pathway.