Ingénierie de bactéries lactiques contre le cancer

Engineering Lactic Acid Bacteria for cancer therapy

• Auteur / Autrice : Elsa Fristot
• Direction : Jérôme Bonnet
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : CBS - Centre de Biologie Structurale
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Biologie synthétique
• Jury : Président / Présidente : Nathalie Bonnefoy
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jérôme Bonnet, Luis Bermudez-humaran, Sarah Lebeer, Pascal Hersen, Guillaume Cambray
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Luis Bermudez-humaran, Sarah Lebeer

Mots clés

Mots clés libres

Biologie Synthétique

ADN recombinant

Lactobacilles

Microbiote

Cancer

Promoter

Synthetic biology

Recombinant DNA

Lactobacilli

Microbiota

Cancer

Promoter

Résumé

En 1890, W. Coley concevait la toxine de Coley, première immunothérapie des cancers, un mélange de deux souches bactériennes inactivées, qui produisait une régression tumorale spectaculaire, mais dont les résultats étaient difficiles à reproduire faute de contrôle sur la dissémination. Nous savons aujourd’hui que le micro-environnement hypoxique, nécrotique et immunosupprimé des tumeurs favorise la colonisation et la croissance de bactéries. Ces dernières années, des bactéries ont été génétiquement modifiées pour détecter et traiter plusieurs pathologies in vivo, notamment des infections, des troubles métaboliques et des maladies inflammatoires de l'intestin. Récemment, de nombreuses études ont été menées pour modifier les bactéries afin de traiter différents types de cancer. La stratégie des bactéries anti-cancer consiste à modifier génétiquement des bactéries afin de les faire reconnaître, coloniser et proliférer dans le microenvironnement tumoral et finalement produire des molécules thérapeutiques in situ de manière contrôlée. Un avantage potentiel de l'utilisation de bactéries comme cargo thérapeutique est de contrer les effets secondaires des traitements systémiques. Grâce au développement du génie génétique et de la biologie synthétique, les bactéries peuvent maintenant être programmées en micro-usines polyvalentes, pour produire différentes classes de molécules thérapeutiques de façon contrôlée notamment via l’implémentation de biocapteurs. Actuellement la majorité des approches utilisent Escherichia coli Nissle 1917, une bactérie à gram-négatif modèle, mais immunogène, dont les capacités de sécrétion et de display ne sont pas optimales, limitant la quantité d’agent thérapeutique produit et donc l’efficacité thérapeutique chez l’humain. Mon projet de thèse consiste à valider l’utilisation de Lactobacillus gasseri ATCC33323, souche probiotique bénéfique et résidente des muqueuses colorectales et vaginales, comme nouvelle plateforme pour traiter les tumeurs solides du cancer colorectal de manière ciblée. Comme l'ingénierie de précision de lactobacilles est présentement limitée par le manque de standardization, de caractérisation et d’accès en open source de systèmes permettant un contrôle fiable de l'expression génétique, j’ai dans un premier temps construit une collection de d'outils génétiques pour contrôler les niveaux de transcription, de traduction et de sécrétion chez L. gasseri. Dans cette « boîte à outils » pour l’ingénierie de L. gasseri j’ai réalisé : i. Des protocoles optimisés permettant leur manipulation, ii. Un kit MoClo de clonage de vecteurs pour bactéries à gram-positif, iii. Une librairie combinatoire de promoteurs et RBS et iv. de nouveaux promoteurs inductibles compatibles avec des approches in vivo. Grâce aux outils développés, j’ai construit deux souches probiotiques recombinantes, L. gasseri ClyA (cytotoxique) et L. gasseri VHH-antiPDL1 (immunomodulatrice). Enfin afin de valider le potentiel de L. gasseri comme châssis pour développer de nouvelles BCT j’ai réalisé des essais de colonisation sur des modèles de tumeurs solides in vitro et in vivo. J’ai démontré que la souche probiotique Lactobacillus gasseri ATCC33323 était capable de coloniser des tumeurs solides colorectales MC38 sur modèle murin par voie intra tumoral et intraveineuse.

In 1890, W. Coley conceived Coley's toxin, the first cancer immunotherapy, which was a mixture of two inactivated bacterial strains that produced a spectacular tumor regression. However, its results were difficult to reproduce due to a lack of control over its dissemination. Today, we know that the hypoxic, necrotic, and immunosuppressed microenvironment of tumors promotes the colonization and growth of bacteria. In recent years, bacteria have been genetically modified to detect and treat various pathologies in vivo, including infections, metabolic disorders, and inflammatory bowel diseases. Recently, numerous studies have been conducted to modify bacteria to treat different types of cancer. The strategy of anti-cancer bacteria involves genetically modifying bacteria to make them recognize, colonize, and proliferate in the tumor microenvironment and ultimately produce therapeutic molecules in situ in a controlled manner. One potential advantage of using bacteria as a therapeutic vehicle is to counteract the side effects of chemotherapy and immunotherapy treatments, which are still generally administered systemically. Thanks to advances in genetic engineering and synthetic biology, bacteria can now be programmed as versatile microfactories to produce different classes of therapeutic molecules (antibodies, enzymes, cytokines) in a controlled manner, notably through the implementation of biosensors. Currently, the majority of approaches use Escherichia coli Nissle 1917, a model Gram-negative bacterium, but it is immunogenic, mainly due to the secretion of lipopolysaccharides (LPS), and its secretion and display capabilities are not optimal, limiting the amount of therapeutic agents produced and thus therapeutic efficacy in humans. My doctoral project aims to validate the use of Lactobacillus gasseri ATCC33323, a beneficial probiotic strain resident in the colorectal and vaginal mucosa, as a new platform for targeted treatment of solid colorectal cancer tumors. As precision engineering of lactobacilli is currently limited by the lack of standardization, characterization, and open-source access to systems allowing reliable control of genetic expression, I first built a collection of genetic tools to control transcription, translation, and secretion levels in L. gasseri. In this "toolbox" for L. gasseri engineering, I have accomplished the following: i. Optimized protocols for their manipulation, ii. A MoClo vector cloning kit for Gram-positive bacteria, iii. A combinatorial library of promoters and RBS (Ribosome Binding Sites), and iv. New inducible promoters compatible with in vivo approaches. Using the tools developed, I constructed two recombinant probiotic strains, L. gasseri ClyA (cytotoxic) and L. gasseri VHH-antiPDL1 (immunomodulatory). Finally, to validate the potential of L. gasseri as a chassis for developing new BCTs (Bacteria-based Cancer Therapies), I conducted colonization assays on in vitro and in vivo solid tumor models. I demonstrated that the probiotic strain Lactobacillus gasseri ATCC33323 could colonize solid colorectal tumors (MC38) in a murine model via intra-tumoral and intravenous administration.